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研究背景:硬脑膜动静脉瘘(dural arteriovenous fistula,DAVF)致死致残率高,尤其是复杂型DAVF,更是难以治愈。静脉高压为DAVF公认的初始诱发因素,可通过组织缺氧和改变血管应力环境诱发DAVF,缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)启动血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)介导的血管新生是其重要环节,但是该通道并不是诱导DAVF发生的唯一通路。有研究发现,人的DAVF标本中VEGF和EphrinB2表达均增加,而二者同时参与新血管的形成过程。因此本研究通过建立不同静脉端压力的大鼠模型,并利用慢病毒载体干预EphrinB2表达水平,检测颅内各组织中EphrinB2的表达水平及对新血管形成的影响,证实EphrinB2在DAVF发生发展中的重要作用;另外通过研究不同剪应力环境下培养的脐静脉内皮细胞中,HIF-1α和EphrinB2的关系,初步探讨启动EphrinB2的上游分子通路。实验目的:1.建立不同静脉端压力大鼠模型,检测在静脉端压力增强的病理改变下,大鼠硬膜上EphrinB2以及VEGFR2表达的空间和时间的分布情况,确认EphrinB2的激活和静脉高压存在相关性;之后通过慢病毒干预EphrinB2的表达水平,检测VEGFR2表达差异,并通过VIII因子免疫组化检测,观察微血管新生活跃程度,确认EphrinB2-VEGFR2通路在静脉高压诱导DAVF的形成中发挥的关键作用;最后通过免疫共沉淀明确EphrinB2与VEGFR2两种蛋白是否发生相互作用。2.将脐静脉内皮细胞在静止环境及不同的剪应力环境下培养,并检测内皮细胞HIF-1α、及Ephri B2/Eph B4表达水平,确认剪应力可以调控Ephri B2/Eph B4的表达水平来调控内皮细胞功能;并通过慢病毒干预内皮细胞HIF-1α的表达水平,检测对EphrinB2/Eph B4表达水平的影响,阐明静脉高压激活EphrinB2/Eph B4通路可能与剪应力调控内皮细胞HIF-1α的表达相关。实验方法:1.建立不同程度静脉端压力大鼠模型,120只雄性SD大鼠随机分为假手术组、静脉窦闭塞组、静脉高压组,分别于术后1天、3天、2周为时间窗,采用石蜡切片免疫组化检测枕叶皮层、窦汇以及硬膜组织等部位的EphrinB2、VEGFR2表达水平,明确表达位置;以术后1天、3天、1周、2周为时间窗,采用RT-PCR方法检测硬膜组织EphrinB2、VEGFR2的转录水平;采用Western blot方法检测硬膜组织EphrinB2、VEGFR2蛋白表达水平。2.构建EphrinB2 sh RNA慢病毒确认体外感染效率,112只雄性SD大鼠随机分为假手术组、静脉高压组、静脉高压并静脉窦内空白慢病毒感染组,静脉高压并静脉窦内EphrinB2 sh RNA慢病毒载体感染,分别于术后1天、1周、4周,采用RT-PCR方法检测硬膜组织EphrinB2、VEGFR2的转录水平;采用Western blot方法检测硬膜组织EphrinB2、VEGFR2蛋白表达水平;采用石蜡切片免疫组化检测枕叶皮层、窦汇以及硬膜组织各部位EphrinB2、VEGFR2及VIII因子表达水平。3.构建EphrinB2慢病毒确认体外感染效率,112只雄性SD大鼠随机分为假手术组、静脉窦闭塞组、静脉窦闭塞并静脉窦内空白慢病毒感染组,静脉窦闭塞并静脉窦内重组慢病毒感染组,分别术后1天、1周、4周,采用RT-PCR方法检测硬膜组织EphrinB2、VEGFR2的转录水平;采用Western blot方法检测硬膜组织EphrinB2、VEGFR2蛋白表达水平;采用石蜡切片免疫组化检测枕叶皮层、窦汇以及硬膜组织各部位EphrinB2、VEGFR2及VIII因子表达水平。4.利用抗体和抗原特异性结合的原理,证实两种蛋白是否能够发生相互作用。5.分别于4、10 dyn/cm2剪应力环境下培养人脐静脉内皮细胞24小时,以静止培养(剪应力=0)内皮细胞为对照。加载结束后观察细胞形态学变化,并采用RTPCR和Western blot法测定HIF-1α及EphrinB2/Eph B4的转录和蛋白表达水平。6.构建HIF-1αsh RNA慢病毒确认体外感染效率,后按10dyn/cm2剪应力环境,10dyn/cm2剪应力环境并空白慢病毒感染、10dyn/cm2剪应力环境并HIF-1αsh RNA慢病毒感染分组,采用RT-PCR和Western blot法测定HIF-1α、EphrinB2/Eph B4的转录和蛋白表达水平。实验结果:1.与对照组相比,静脉窦闭塞组和静脉高压组大鼠硬膜组织中EphrinB2、VEGFR2表达明显增加。免疫组化结果显示,与对照组相比,可见EphrinB2、VEGFR2在窦汇及硬膜组织中表达明显,窦汇表达部位主要在血管内皮层。2.与静脉高压并静脉窦内空白慢病毒感染组相比,静脉高压并静脉窦内EphrinB2sh RNA慢病毒载体感染后,窦汇及硬膜组织的EphrinB2的表达明显受到抑制,VEGFR2表达显著减少,VIII因子微血管增生受到抑制,脑组织内无显著变化。3.与静脉窦闭塞并静脉窦内空白慢病毒感染组相比,静脉窦闭塞并静脉窦内重组EphrinB2慢病毒感染组中,窦汇及硬膜组织EphrinB2的表达显著增加,VEGFR2表达显著增加,VIII因子微血管增生活跃,脑组织内无显著变化。4.免疫共沉淀反应中,EphrinB2可以在胞内与VEGFR2发生相互作用;5.与静止培养组相比,4、10 dyn/cm2剪应力环境下脐静脉内皮细胞EphrinB2/Eph B4表达均显著增加,4dyn/cm2剪应力环境下HIF-1α表达无明显差异,10dyn/cm2环境下HIF-1α表达显著增加。6.与10 dyn/cm2剪应力环境并空白慢病毒感染组相比,内皮细胞在10 dyn/cm2剪应力环境下沉默HIF-1α后,HIF-1α表达显著减少,EphrinB2/Eph B4表达无明显差异。实验结论:1.EphrinB2能与VEGFR2发生特异性相互作用,静脉高压环境下,硬膜组织中的EphrinB2表达增加,并上调VEGFR2介导的血管新生,使血管新生活跃。2.EphrinB2/Eph B4通路激活与静脉高压造成的静脉内高剪应力环境有关,静脉高压激活EphrinB2/Eph B4通路与高剪应力介导内皮细胞HIF-1α表达无关。