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研究背景及意义心血管疾病是慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD)患者最常见的并发症和首要死亡原因。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)斑块破裂是心血管恶性事件发生的重要病理基础,AS斑块的纤维帽变薄是发生斑块不稳定性和斑块破裂的重要原因。CKD患者急性心肌梗塞的发生率是普通人群的7.4倍,提示CKD患者的AS不稳定性更易发生。已知,AS 斑块纤维帽中的 VSMCs(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)的活性和数量是维持纤维帽厚度和AS斑块稳定性的关键因素,纤维帽中的VSMCs衰老是导致AS斑块破裂的重要机制。众所周知,CKD是一种衰老相关的疾病,复杂的CKD内环境能导致细胞衰老,进而导致机体衰老,因此,VSMCs衰老在CKD相关AS斑块不稳定性中的作用和机制需要高度关注,对此问题的探讨将有助于揭示CKD内环境下心血管恶性事件高发生率的原因。cGAS(Cyclic GMP-AMP synthase)是一种双链DNA传感器,在固有免疫中发挥着重要作用。既往研究表明cGAS可以识别自身泄漏或外源侵入细胞质的DNA,从而催化 cGAMP(Cyclic GMP-AMP)的合成。cGAMP 通过活化 STING-TBK1-IRF3 信号通路诱导I型干扰素(IFN-I)的生成,进而抵抗病原体的攻击。新近研究提示,cGAS-STING信号通路活化在细胞衰老中扮演关键角色。在外源性因素诱导细胞损伤后,cGAS可以识别细胞自身泄漏的DNA,进而促进IFN-I生成,最终通过自分泌和旁分泌的形式引起不可控的炎症反应,导致细胞衰老或衰老表型进一步加重。但是,cGAS-STING信号通路活化在VSMCs衰老和AS斑块不稳定性中的作用并不明确,特别是CKD致衰老内环境下,其是否发挥了关键作用值得深入研究。为此,本研究以Apoe-/-小鼠、Apoe-/-小鼠制备的CKD模型、人VSMCs系以及原代培养的VSMCs作为研究对象,首先明确了 AS斑块纤维帽中的VSMCs出现衰老,CKD Apoe-/-小鼠表现的更为明显。通过基因芯片检测小鼠VSMCs基因分析发现JAK-STAT1信号通路和I型IFN反应在CKD组明显活化,并通过体内外研究阐明cGAS-STING信号通路活化诱导了Ⅰ型IFN反应,在VSMCs衰老中发挥关键作用。随后,我们通过蛋白质组学检测小鼠血管组织蛋白表达变化,联合基因芯片结果分析,发现并证实线粒体损伤参与了 CKD促VSMCs衰老和AS斑块不稳定性,并介导了 cGAS-STING信号通路的活化。进一步研究发现,CKD导致了 AS斑块纤维帽中VSMCs大量的ROS生成,线粒体损伤和mtDNA泄漏,mtDNA与cGAS结合激活STING-TBK1-IRF3信号通路,诱导IFNβ的生成,加速VSMCs衰老。而我们既往研究发现,肾脏分泌的抗氧化应激蛋白Klotho具有重要的心血管保护作用,它可以通过抑制ROS生成,减轻CKD导致的VSMCs衰老和AS斑块不稳定性。本课题主要分以下5个部分对VSMCs衰老在CKD相关AS斑块不稳定性中的作用与机制进行了研究:①VSMCs衰老在CKD相关AS斑块不稳性中的作用研究;②IFN-Ⅰ反应在CKD所致VSMCs衰老中的作用研究;③cGAS-STING信号通路介导IFN-Ⅰ反应、VSMCs衰老和CKD相关AS斑块不稳定性的研究;④ROS生成增多诱导的线粒体损伤在cGAS-STING信号通路活化和VSMCs衰老中的作用;⑤Klotho通过抑制ROS生成减轻VSMCs衰老和CKD相关AS斑块不稳定性。主要研究结果及结论如下:1、CKD诱导加速性AS斑块纤维帽中VSMCs和体外培养的VSMCs衰老:Apoe-/-小鼠分为 ND(Normal Diet)组、AS 组、AAS(Accelerated Atherosclerosis)组进行研究。与AS组比较,AAS组的斑块面积显著增加、寿命明显缩短、心肌梗死的发生率升高、纤维帽变薄并伴随VSMCs数量减少。通过免疫组化、免疫荧光双重染色、Western blot检测发现 AAS 组小鼠 VSMCs 中 SAβG(senescence-associated β-galactosidase,SAβG)、p53和p16表达较AS组小鼠显著增加。利用CKD 5期患者血清孵育人VSMCs细胞系(hVSMCs)后,进一步明确CKD复杂内环境可以显著诱导SAβG、p53和p16的表达。上述结果提示,CKD加速AS和斑块不稳定性,CKD诱导的VSMCs衰老在其中发挥重要作用。2、Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)反应参与CKD诱导的VSMCs衰老和斑块不稳定性加剧:通过对小鼠VSMCs进行流式分选、提取RNA进行基因芯片检测分析,发现AAS组和AS组小鼠JAK-STAT1-IFN-Ⅰ的表达显著上调,AAS组则更为显著。通过免疫荧光双重染色和Westernblot检测证实小鼠VSMCs中IFNβ及p-STAT1、MX1和IRF7的表达增高,在AAS组更为明显。上述结果也在CKD 5期患者血清孵育的hVSMCs中得以进一步证实。在体外,IFNβ处理hVSMCs后,可以抑制VSMCs中Ki-67+细胞比例,增加SAβG+和p53的表达,下调α-SMA的表达。相反,IFNARl-/-/Apoe-/-双敲小鼠VSMCs中SAβG+细胞比例和p53的表达均显著降低;通过siRNA敲低hVSMCs中IFNAR1和STAT1的表达,减弱了 CKD血清孵育导致的VSMCs衰老。上述结果表明,IFN-I及STAT1的活化在CKD诱导的VSMCs衰老中发挥重要作用。3、cGAS-STING信号通路介导了促发CKD VSMCs衰老和斑块不稳定性加剧的IFN-I反应:免疫荧光染色、流式细胞术和Western blot检测发现小鼠VSMCs p-TBK1和p-IRF3的表达显著上调,AAS组的改变更为明显。上述结果在CKD 5期患者血清孵育的hVSMCs中得以证实。利用siRNA敲低hVSMCs中cGAS、STING和IRF3的表达,流式细胞术检测发现,抑制了 CKD血清导致的IFNβ表达增高、SAβG+细胞比例增加及α-SMA 表达下调。在 cGAS-/-/Apoe-/-、STING-/-/Apoe-/-和 IRF3-/-/Apoe-/-双敲小鼠和CKD/Tagln-Sting小鼠的AS斑块中也发现上述改变,并且双敲小鼠的斑块面积显著减小、纤维帽厚度明显增加。以上结果提示,cGAS-STING信号通路在IFN-Ⅰ反应以及VSMCs衰老、斑块不稳定性中扮演重要角色,CKD会加重cGAS-STING的活化,抑制cGAS-STING可以显著改善CKD诱导的VSMCs衰老及斑块不稳定性加剧。4、VSMCs中线粒体损伤导致cGAS-STING信号通路活化和IFN-Ⅰ反应免疫荧光染色观察到AS和AAS小鼠纤维帽VSMCs中出现DNA与cGAS的共定位,在AAS小鼠更为明显。在CKD患者血清孵育的hVSMCs中也证实了 DNA与cGAS的共定位。通过ChIP检测与cGAS共沉淀的DNA片段,结果显示,CKD患者血清孵育VSMCs后,出现明显的mtDNA富集。用EtdBr清除VSMCs内的mtDNA,可以显著抑制CKD患者血清诱导的IFNβ和SAβG+细胞比例的增加及α-SMA表达下调。透射电镜观察到小鼠AS斑块纤维帽中VSMCs线粒体结构受损,流式细胞术检测线粒体通透性转换孔(MPTP)开放增加,在AAS组更为明显。在体外,上述结果得以证实,并且发现CKD血清孵育VSMCs后ATP生成减少并出现线粒体能量代谢障碍。当使用MPTP抑制剂环孢素(CsA)预处理hVSMCs后,能够有效抑制CKD血清诱导的IFNβ和SAβG+细胞比例的增加及α-SMA表达下调。以上结果说明,线粒体损伤导致的mtDNA释放是VSMCs中cGAS-STING活化和IFN-Ⅰ反应的重要诱因。5、CKD内环境紊乱导致的VSMCs ROS生成增多诱导了线粒体损伤在AS和AAS小鼠斑块中DHE染色检测到ROS生成增多,纤维帽VSMCs中观察到8-OH-dG与cGAS的共定位,AAS组2种染色更为显著。CKD 5期患者血清孵育6或12小时后,DCFH探针显示VSMCs中ROS生成显著增加,且早于MPTP开放。使用ROS清除剂NAC预处理,可以显著减轻CKD引起的线粒体损伤和IFNβ表达增高及VSMCs衰老。因此,CKD导致的VSMCs ROS生成增多在线粒体损伤及IFN-Ⅰ反应中起着关键作用。6、外源性补充Klotho蛋白显著抑制CKD诱导的VSMCs ROS生成、衰老和斑块不稳性加剧免疫荧光染色和Western blot检测发现,Klotho在AAS小鼠VSMCs中的表达显著降低;在体外,CKD患者血清孵育同样导致hVSMCs中Klotho表达降低。利用Klotho+/+/apoe-/-小鼠、Klotho+/-/apoe-/-小鼠制备 CKD 模型,发现 Klotho+/-/apoe-/-小鼠 AS斑块更大,纤维帽变薄,ROS生成增多。说明CKD可以导致VSMCs自身Klotho表达下调,而Klotho缺乏可以加重CKD诱导的VSMCs衰老和斑块不稳定性。通过外源性补充Klotho可以显著抑制CKD诱导的动脉粥样硬化斑块进展、ROS过度生成、纤维帽变薄、纤维帽中的VSMCs减少和衰老。这些结果表明,Klotho蛋白可以通过抑制ROS生成减轻CKD诱导的AS加速进展、VSMCs衰老和斑块不稳定性加剧。综上所述,本研究发现CKD导致VSMCs衰老和斑块不稳定性增加。机制研究表明,cGAS-STING信号通路活化引起的IFN-Ⅰ反应在VSMCs衰老中扮演重要角色,而CKD诱导的ROS生成增多和线粒体损伤是激活cGAS-STING信号通路和IFN-Ⅰ反应的关键因素。通过干预cGAS-STING信号通路和IFN-Ⅰ反应,或外源性补充Klotho蛋白可以显著改善CKD导致的VSMCs衰老和斑块不稳定性加剧,为CKD相关的AS斑块不稳定和恶性心血管事件的防治提供了新思路和新靶点。