肺炎链球菌是中枢神经系统感染的常见病原体。近年来,随着经济和健康状况的改善以及医疗水平的提高,发病率及死亡率已经有所下降。然而,目前预后结果仍然不能令人满意,并且往往存有某些神经系统后遗症。因此,研究肺炎链球菌脑膜炎具有深远意义。小胶质细胞作为大脑中炎症免疫反应的重要贡献者,是脑中的单核细胞,具有抗原呈递、细胞因子分泌和吞噬作用。研究表明,小胶质细胞有跨膜Toll样受体(Toll-like family of pattern recognition receptors,TLRs)和胞浆内 Nod 样受体(nucleotide-binding domain leucine-rich repeat region-containingfamily of proteins,NLRs)的分布。NOD2蛋白是NLRs家族的重要成员之一,其作为克罗恩病的相关基因目前已逐渐明确。与此同时,它在中枢神经系统中致病微生物的识别和炎症诱导中的重要作用目前也受到关注。NOD2蛋白可识别胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP),一种存在于革兰氏阴性和阳性细菌胞壁肽聚糖(peptidoglycan,PGN)的裂解产物。NOD2蛋白与配体结合后,可激活NF-κB通路诱导炎性细胞因子TNF-α和IL-6等的释放。研究证实,NOD2介导的巨噬细胞免疫耐受可以抑制炎性因子的过度表达并保护机体。我们实验以前的研究证实,小胶质细胞中也存在NOD2介导的免疫耐受。尽管这些炎性细胞因子保护机体免受病原微生物的侵害,但缺少适度调节就会产生过量的炎性细胞因子,导致微循环障碍和对正常组织的损害。因此,NOD2病理生理的深入研究将有助于为治疗肺炎链球菌脑膜炎提供新思路。目前肺炎链球菌脑膜炎的临床治疗主要根据病原学进行抗感染治疗。现状是简单的抗感染治疗不能解决患者脑组织感染后继发的免疫损伤问题。体外研究表明神经胶质细胞受脂多糖刺激,细菌暴露后小胶质细胞活化受到糖皮质激素的限制。然而,随机临床试验表明,细菌性脑膜炎治疗中糖皮质激素的辅助作用存在着支持和不赞成两种派系,而且目前还没有进一步进行有关糖皮质激素对NOD2在肺炎球菌性脑膜炎影响的研究。RNA干扰是使用双链RNA(dsRNA)分子沉默mRNA水平上特定基因序列表达的过程,即序列特异性转录后基因沉默。其作用的基本原理为利用一些20bp左右的双链siRNA(small interferencingRNA),结合到核酶复合物形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),激活的 RISC 通过碱基配对与同源mRNA结合并切割它,从而破坏特定目的基因的转录产生的mRNA,使其功能沉默。人们已经认识到RNA干扰技术在基因治疗中的潜力,并进一步将其运用到临床实验。考虑到NOD2在中枢神经系统感染发病机制中的作用,选择NOD2作为着手点,研究NOD2在肺炎链球菌脑膜炎的表达及对血脑屏障的影响;探讨地塞米松作为一种常见的糖皮质激素,辅助治疗肺炎链球菌脑膜炎预后的影响和应用RNA干扰技术基因敲除NOD2表达,观察模型大鼠可能的治疗效果。1.NOD2在肺炎链球菌脑膜炎中的表达及其对血脑屏障的影响目前认为模式识别受体诱导细胞因子的释放和炎症级联反应在脑组织免疫损伤中的机制受到了许多学者的重视。本研究旨在探讨肺炎链球菌脑膜炎大鼠脑组织核苷酸结合寡聚化结构域2(NOD2)和炎性因子表达的变化及其对血脑屏障(BBB)通透性的影响。成功建立Wistar大鼠肺炎链球菌脑膜炎模型后,用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测不同时间点(0h、12h、24h、48h、7d)NOD2和炎性因子的表达变化曲线。采用Western印迹和实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测NOD2蛋白的表达。观察病理形态学、神经学评分、脑含水量(BWC)和血脑屏障通透性的变化。结果表明:免疫组化法检测感染的Wistar大鼠脑膜、脑实质和树突状细胞中均发现NOD2蛋白阳性表达。肺炎链球菌感染后12小时,NOD2表达开始增加,其余炎性因子无显著性增加。同时,24h、48h感染组NOD2、炎性因子IL-1β、TNF-α和IL-6水平显著升高;7d组TNF-α和IL-6水平仍持续在高水平,IL-1β表达水平下降,这表明它可作为早期炎性指标而不能作为晚期评价指标。随感染时间延长和NOD2及炎性细胞的高表达,血脑屏障通透性及脑组织水含量增高,脑水肿加重,急性发作期(24h-48h)血脑屏障损伤最为明显,神经系统评分与血脑屏障通透性和脑水肿程度成负相关。结论:NOD2高表达激活炎症通路,破坏神经、血管基质影响神经血管的完整性,脑水肿可能是血脑屏障开放的结果;中枢神经系统促炎性细胞的侵润是导致脑损伤的原因之一。2.探讨地塞米松辅助治疗对肺炎链球菌脑膜炎预后的影响目前,简单的抗感染治疗无法解决脑膜炎脑组织的免疫损伤问题。地塞米松作为一种广泛使用的抗炎药,研究发现其能够抑制炎症介质合成,降低其活性并降低血管通透性,减轻脑水肿和颅内高压,增加脑血流,改善大脑新陈代谢。然而,大型临床随机对照实验的结果仍存在争论。本研究从分子水平、组织形态学改变及神经功能评分、Morris水迷宫等方面比较了辅助地塞米松治疗组与单纯抗生素组Wistar大鼠的情况。将肺炎链球菌注射入大鼠小脑池,建立脑膜炎模型,随机分为对照组、感染组、头孢曲松组、早期地塞米松辅助治疗组、晚期地塞米松辅助治疗组。采用ELISA方法测定脑组织蛋白NOD2、IL-1β、TNF-α和IL-6表达,通过脑组织病理切片HE染色观察组织形态学变化。各组经不同处理后第7天进行神经功能评分,Morris水迷宫实验进行空间记忆能力分析。与对照组相比,感染组NOD2、TNF-α、IL-1β和IL-6表达显著增加,头孢曲松组和晚期地塞米松组表达也相应升高,早期地塞米松组无显著性差异;与头孢曲松组比较,早期地塞米松组优于晚期地塞米松组。HE染色正常对照组大鼠脑组织结构正常;在感染组中,观察到间质水肿,中性粒细胞浸润,一些神经细胞变性坏死,血管破坏,局部出血性坏死;与感染组比较,头孢曲松组和地塞米松辅助治疗组炎性细胞浸润减少,间质水肿较前减轻;与头孢曲松组相比较,晚期地塞米松辅助治疗组无显著性差异,早期地塞米松辅助治疗组大鼠中性粒细胞浸润减少,血管壁基本完好,间质水肿减轻明显。神经系统评分结果与细胞因子表达和病理性改变成负相关。Morris水迷宫结果显示:感染组大鼠寻找水中平台时间与正常组比较明显延长,提示肺炎链球菌脑膜炎大鼠存在空间记忆功能缺陷。头孢曲松组与地塞米松辅助治疗组虽然缩短了水中寻找平台时间,但三组数据之间无显著性差异。结论:早期地塞米松辅助治疗在改善肺炎链球菌预后方面优于晚期地塞米松辅助治疗组,但是对改善大鼠学习记忆功能影响不大。3.NOD2 siRNA抑制炎症因子对肺炎链球菌大鼠脑损伤的保护作用第一部分研究表明,核苷酸结合寡聚化结构域2(NOD2)基因在脑膜炎脑损害中起着重要作用。下面实验通过敲除NOD2基因,评价Wistar大鼠NOD2和炎性因子的表达,分析神经评分和生存率,为寻找改善脑膜炎预后的手段提供依据。方法以NOD2为靶基因,评价RNA干扰技术治疗脑膜炎大鼠模型的可能结果。设计三组NOD2 siRNA序列和一组非特异性序列,通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)优选最佳NOD2siRNA序列用于脑内注射。通过qRT-PCR、Western印迹和免疫组织化学法检测脑组织样品中NOD2的表达水平。随后,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平。此外,伊万斯蓝(EB)染色和脑组织水含量测定评估了血脑屏障通透性。神经系统评分和生存率评估预后。结果显示:NOD2在肺炎链球菌脑膜炎脑组织中的高表达。小干扰(SI)引起NOD2水平降低并通过NF-κB途径抑制TNF-α、IL-6和IL-1β炎性因子的分泌,大鼠脑水肿和BBB渗漏减少,显著提高大鼠神经系统评分和生存率。本研究表明,NOD2 siRNA通过抑制NF-κB途径减少肺炎链球菌感染过程中的炎症反应,对改善肺炎链球菌脑膜炎大鼠生存率和预后有重要意义。基于这些研究结果,我们认为抑制NOD2表达可能是治疗肺炎链球菌感染的新策略。总之,本研究表明NOD2在肺炎链球菌脑膜炎的发病机制中起着重要作用。地塞米松辅助治疗和NOD2-siRNA干扰技术有望成为肺炎链球菌脑膜炎的治疗手段,为其临床应用提供依据。