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背景：各种原因造成的骨缺损、骨不连一直是外科领域中的老难题。其根本原因是尚未找到一种理想的骨替代物，其要求是：1、与人体组织相容性好，无免疫源反应；2、与人骨力学性能相似，具有一定的强度和支撑力；3、应有良好的诱导成骨活性；4、取材方便，易于大量制作；5、能被宿主骨组织吸收替代。在骨组织修复领域，现行的材料都不十分理想，传统的植入材料，例如：金属、陶瓷、高分子植入物在人体内永远是异物，在生物相容性、生物活性、生物可降解性及与宿主骨的力学匹配性等方面都有各自的缺点，自体骨移植效果虽好，但来源有限，尤其是儿童和老人。 目的：研制一种具有骨诱导能力和一定强度，适于成骨细胞爬行替代的可降解高孔隙率支架作为细胞载体材料。 我们通过与天津大学材料学院、中科院固体材料研究所合作，将纳米氧化锆颗粒和羟基磷灰石复合制备出一种孔隙率高，抗压强度大的磷酸钙成骨细胞爬行支架生物陶瓷。 方法：通过以下方面进行研究 一、支架的制备 实施方法： 1、羟基磷灰石制备 以医用级碳酸钙（CaCO3）和二水磷酸氢钙（CaHPO4.2H2O）为原料，经过热反应，获得长径比约为10的针状羟基磷灰石粉末。 2、制备纳米氧化锆颗粒，氧化锆粉末的粒径为20～50nm。 3、称取一定比例纳米氧化锆颗粒和羟基磷灰石粉末制备成料浆，选用孔隙率92％，孔径300um的聚氨酯海绵并用NaOH碱液处理，然后浸入料浆中，而后将浸有料浆的海绵取出，通过碾轮将海绵中的多余料浆碾出；被料浆包裹的海绵成型体烧结。制备出纳米氧化锆增强β-磷酸钙（β-磷酸钙／氧化锆）高孔隙率成骨细胞爬行支架。 结果： 经过天津大学材料学院测试：孔隙率为75％～93％，孔径大小在200～450μm之间，孔分布均匀、贯通，抗压强度2.0MPa。 二、支架的生物学评价 实施方法：第<sub>军医大学中文摘要 1、细胞毒性实验:本实验采用纳米支架材料的浸提液，按下面两种方法进行实验: （l）细胞形态观察法:将待测材料及阴、阳性参照材料分置中35nl们n培养皿内，加入细胞浓度为6xl了/ml的L一929细胞悬液3ml，通过倒置显微镜观察试样边缘细胞形态及生长情况。 （2）MTT法:细胞相对增值率（RGR）:（实验组A均值/阴性对照组A均值）X 100%，再根据计算值进行细胞毒性分级。 2、急性全身毒性试验:本实验采用支架材料的浸提液小鼠尾静脉注射，阴性对照为同批号生理盐水，阳性对照为6.4%苯酚溶液，注射后24h、48h、72h称量体重变化，观察一般状态、毒性表现及死亡情况。 3、溶血试验:本实验采用支架材料的浸提液作体外实验，测定兔红细胞溶解和血红蛋白游离程度，对其体外溶血性进行评价。 结果: 1、支架材料细胞毒性为O一1级 2、支架材料组小鼠的全身一般状况良好，未见明显毒性表现，体重均出现 增长现象，72h观察期内活动如常，饮食饮水均正常，无动物死亡现象。 3、支架材料的溶血率为2.40%，体外实验不引起溶血反应 三、MC一3T3EI细胞与支架联合培养实验 实施方法: 1、用类成骨细胞株MC一3T3EI与纳米支架浸提培养液和正常培养液培养，分别倒置显微镜观察细胞生长、增殖情况，并统计细胞成活率，了解支架材料对细胞生长的影响，并绘制出细胞生长曲线。 2、用类成骨细胞株MC一3T3EI与支架复合进行培养，电镜观察细胞与支架材料载附情况，判断支架材料对细胞勃附性能。 结果: 实验中观察到纳米支架浸提液培养液培养类成骨细胞株MC一3T3EI其生长曲线与正常培养液培养无显著差异，两条生长曲线基本重叠。两组细胞均表现出了相同的趋势和规律。MC一3T3EI在支架勃附爬行情况良好。 四、原代兔成骨细胞培养 实施方法: 1、兔骨髓基质干细胞培养用含诱导作用的培养液（IOmmol/Lp一甘油磷酸钠，IOlimol/L地塞米松，50mg/nll抗坏血酸）继续培养，镜下观察成骨细胞形态。第一军日一人学中文摘要 2、成骨细胞的鉴定 2.1碱性磷酸酶染色 细胞爬片经固定后行改良钙钻法进行碱性磷酸酶染色，可见细胞质与细胞膜上有粗大的深褐色颗粒存在，有些甚至成片而遮蔽细胞核。 2.2碱性磷酸酶活性定量测定（测定盒购自南京建成生物工程研究所） 碱性磷酸酶分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨基安替毗琳作用经铁氰化钾氧化生成红色醒衍生物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低。 2.3成骨细胞蛋白质定量测定 蛋白质分子具有一NH3基团，当棕红色的CBBG25O染料上的阴离子与蛋白一NH3结合，使溶液变成为蓝色，通过测吸光度可以计算出蛋白含量 结果: 兔骨髓基质干细胞经诱导培养表现出成骨细胞形态改变。经碱性磷酸酶染色鉴定为活跃的成骨细胞，染色结果判定为3+。碱性磷酸酶活性检测，亦验证了诱导培养成骨细胞成功。 五、原代兔成骨细胞与纳米支架联合培养 实施方法: 用第3代兔成骨细胞与支架联合进行培养。并利用改进的MTT法进行三维支架中兔成骨细胞的定量检测。观察成骨细胞在