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非洲猪瘟(African swine fever,ASF),一种高致病性传染病,由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起,其临床症状主要以发热、呼吸和神经系统功能紊乱、内脏器官病变广泛性出血为主。目前ASF无有效的商品化疫苗可以预防、治疗,一经发现只能大规模扑杀,因此寻找和筛选ASFV基因组编码的具有良好免疫原性的蛋白,对于ASFV的致病性研究和检测试剂盒的开发具有重要意义。利用TMHMM分析软件,对ASFV基因组编码的169个蛋白序列进行了分析,发现ASFV编码的35个蛋白有一个或多个跨膜区域,利用WB检测蛋白的表达情况并通过IFA方法鉴定亚细胞定位,发现E199L、KP117R、E183L、B169L、DP148R、E146L、EP84R、EP402R、H108R具有明显的细胞膜定位。本研究根据已经公布的ASFV HLJ/18分离株的基因组的开放阅读框(open reading frames,ORFs)合成ASFV 169个ASFV基因组编码可能的基因,并克隆到pCAGGS-Flag载体,成功构建了169个真核表达质粒。这些ASFV编码蛋白在HEK293T细胞表达后,通过WB和IFA的方法鉴定与ASFV感染猪血清(ASF阳性血清)反应的蛋白,发现9个ASFV编码的蛋白,pCP312R、p30(CP204L)、p54(E183L)、p12(O61R)、pK145R、pK205R、p17(D117L)、pA137R、pA104R与ASF阳性血清有良好反应,其中p12(O61R)、p17(D117L)、p54(E183L)是具有预测跨膜区的膜蛋白,提示这些ASFV编码蛋白可能具有良好的免疫原性。根据p17蛋白的亲疏水性和前期结果分析,截取p17蛋白61-117aa,合成小肽,作为包被抗原,筛选了最佳抗原包被浓度与被检血清最佳稀释度、最佳封闭液与封闭时间、待检血清的工作时间、兔抗猪IgG酶标抗体孵育条件、显色时间,初步建立了针对ASFV p17蛋白的间接ELISA检测方法。我们通过研究还发现,与Belin和BAV71毒株的不同,ASFV HLJ/18毒株编码的毒力相关蛋白pDP148R只含有237氨基酸,该蛋白的C端可能含有一个核定位序列,但表达的全长DP148R蛋白定位在HEK293T细胞膜上,并可以引起部分细胞死亡。利用原核表达系统表达和纯化了pDP148R蛋白,免疫小鼠后取脾细胞与骨髓瘤细胞融合,成功制备了抗DP148R蛋白的单克隆抗体。综上所述,本研究发现35个ASFV编码的蛋白是有跨膜区的膜蛋白,并证实其中3个具有良好的免疫原性;初步建立了针对ASFV p17蛋白的间接ELISA检测方法;成功制备了pDP148R的单克隆抗体。我们的研究将为ASFV重要功能膜蛋白功能研究及ASF检测方法的开发奠定了坚实的基础,也将为ASF的防控提供科学支撑。