研究背景卵巢恶性肿瘤(ovarian malignant tumors, OMT)是女性常见的生殖系统恶性肿瘤,在妇科生殖系统恶性肿瘤中发生率居第三位,死亡率居首位。由于起病隐匿,进展快,且缺乏有效的早期诊断方法,70%患者就诊时已属晚期。卵巢癌中约90%是上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, EOC),癌细胞具有较高的恶性生物学行为,易发生盆腹腔内广泛种植或转移。卵巢癌的治疗方案是肿瘤细胞减灭术加术后联合化疗,但对化疗药物出现耐药、或化疗药物的副作用是导致化疗中断的主要因素,使卵巢癌患者五年生存率仅为15%-30%。因此,研究卵巢癌发生、发展机制,从分子水平上寻找合理有效的治疗靶点,是提高卵巢癌生存率、延长生存期的关键。传统上认为,脂肪酸合成是合成代谢的能量储存通路,而近年来的研究提示它是多种肿瘤细胞转化及增殖的关键过程。人体内的脂肪酸有两个来源：直接来源于外界摄入的外源性脂肪酸,和体内自身合成的内源性脂肪酸。正常情况下,在外源性脂肪酸充足时人体组织几乎不需要脂肪酸的合成,内源性脂肪酸的合成处于低水平；而在恶性肿瘤组织中,内源性脂肪酸合成显著增加,明显高于正常组织,且不受正常细胞中脂肪酸合成途径调节的影响。因此,脂肪酸合成代谢异常已被认为是肿瘤细胞的特征性改变。代谢异常的主要原因是脂肪酸合成通路上的关键酶表达失常,导致酶活性的增高或降低,而酶表达失常又是基因调控和表达改变的结果。因此,对内源性脂肪酸合成通路上关键酶的研究,有助于多种肿瘤的诊断,并可为肿瘤生物学治疗开拓新的思路。ATP-柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase, ACL)在脂肪酸合成中负责催化将柠檬酸以及辅酶A转化为乙酰CoA及草酰乙酸的过程,乙酰CoA是内源性脂肪酸合成的主要原料,也是合成胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质,是体内能源物质代谢的枢纽性物质。因此ACL位于脂质代谢通路的最上游,是糖代谢(产能)与脂质代谢之间的桥梁。现已发现ACL在膀胱癌、乳腺癌、肝癌、胃癌及肺癌等多种肿瘤中表达升高或活化增强,但在卵巢癌中尚无报道。本研究应用Real-time RT-PCR、Western-blot;和免疫组化方法检测ACL在上皮性卵巢癌组织中的表达,并通过RNAi技术抑制卵巢癌细胞系中ACL表达,观察降调ACL表达对卵巢癌细胞生物学行为的影响,探讨ACL在卵巢癌发生、发展中的作用,为寻找卵巢癌诊断及治疗的新靶点提供理论依据。第一部分ATP-柠檬酸裂解酶在上皮性卵巢癌组织中的表达及意义研究目的：检测正常卵巢组织和上皮性卵巢癌组织中ACL mRNA和蛋白表达,分析ACL表达与EOC临床病理特征间的关系,探讨ACL在上皮性卵巢癌发病中的作用。检测固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1)的蛋白表达,探讨SREBP-1表达与ACL表达间的关系。资料与方法：1.研究对象选取2004年1月至2008年12月山东大学齐鲁医院临床资料完整、经手术切除并经病理证实的上皮性卵巢癌标本82例。年龄30～73岁。病理诊断和分期以WHO分级标准和FIGO分类标准判断。所取标本经10%甲醛固定,石蜡包埋,4μm连续切片,待行免疫组化检测。收集山东大学齐鲁医院手术病理证实的新鲜上皮性卵巢癌组织标本18例,另取因其他疾病手术切除的正常卵巢组织12例(经病理证实为正常卵巢组织)作为对照,组织标本离体后立即置于液氮罐内迅速冷冻,然后移入-80℃冰箱保存,待行Real-time RT-PCR和Western blot方法检测。收集患者完整的临床信息(包括EOC患者的年龄、FIGO分期、病理类型、组织分化、肿瘤大小、是否存活等)并对所得数据进行统计分析。本研究经齐鲁医院伦理委员会批准,取得患者知情同意并签署知情同意书。2.研究方法应用实时定量RT-PCR (Real-time reverse transcription polymerase chain reaction, Real-time RT-PCR)及蛋白免疫印迹杂交(Western-blot)分别检测ACL在18例上皮性卵巢癌组织及12例正常卵巢组织中的mRNA和蛋白表达水平。应用免疫组化方法(immunohistochemistry)检测82例上皮性卵巢癌组织中的ACL表达。Western-blot和免疫组化方法检测SREBP-1的蛋白表达。应用SPSS17.0统计软件,良、恶性组织中ACL表达的差异采用Mann-Whitney U Test; ACL表达与EOC临床病理特征间的关系采用Fisher’s test;随访82例患者的生存时间,单因素生存分析采用Kaplan-Meier曲线和log-rank法,用COX风险比例回归模型进行多因素生存分析。3.评分标准根据ACL及p-ACL染色强度的不同,将其评分为0分(不着色)、1分(浅黄色)、2分(棕黄色)、3分(棕黄-黄褐色)、4分(黄褐色),将0-2分定义为低表达,3-4分定义为高表达。因此,ACL、p-ACL、SREBP-1在上皮性卵巢癌组织中的表达均可分为高表达组和低表达组。结果：1.ACL mRNA在EOC和正常卵巢组织中的表达应用Real-time RT-PCR检测ACL mRNA在上皮性卵巢癌和正常卵巢组织中的表达,结果显示ACL mRNA在上皮性卵巢癌组织中的相对表达量(2-△CT)为0.0154±0.00500,正常卵巢组织中的相对表达量(2-△CT)为0.0042±0.00085,ACLmRNA水平在上皮性卵巢癌组织中明显升高,差异具有统计学意义(p<0.01)。2.ACL在EOC和正常卵巢组织中的蛋白表达应用Western-blot检测上皮性卵巢癌组织中ACL及其磷酸化活性形式phospho-ACL(p-ACL)的蛋白表达,结果显示上皮性卵巢癌组织中ACL及p-ACL的蛋白表达水平明显高于正常卵巢组织,差异具有统计学意义(p<0.05)。SREBP-1的蛋白表达与ACL及p-ACL的蛋白表达均无相关性。3.ACL及p-ACL在82例EOC组织中的蛋白表达及与临床病理特征之间的关系3.1ACL及p-ACL在EOC组织中的表达部位应用免疫组化方法检测ACL及p-ACL在上皮性卵巢癌组织中的表达,结果显示,ACL及p-ACL主要在胞浆中表达,少数病例出现胞核表达,且在82例上皮性卵巢癌组织中均有不同程度的阳性表达。3.2p-ACL在EOC组织中的蛋白表达及与临床病理特征的关系在82例上皮性卵巢癌组织中,p-ACL高表达率为64.6%(53例/82例),p-ACL低表达率为35.4%(29例/82例)。上皮性卵巢癌高(Ⅰ级)、中(Ⅱ级)、低分化(Ⅲ级)组织中p-ACL高表达率分别为30%(3例/10例)、63.2%(12例/19例)71.7%(38例/53例),差异具有统计学意义(p=0.044)。FIGO分期Ⅰ-Ⅱ期患者中p-ACL高表达率为42.9%(9例/21例),Ⅲ-Ⅳ期患者中高表达率为72.1%(44例/61例),Ⅲ-Ⅳ期患者的p-ACL高表达率明显高于Ⅰ-Ⅱ期患者,差异具有统计学意义(p=0.020)。p-ACL蛋白水平与年龄、肿瘤大小、组织类型无显著相关(p>0.05),与SREBP-1的表达水平也无显著相关性(p>0.05)。3.3ACL在EOC组织中的蛋白表达及与临床病理特征的关系在82例上皮性卵巢癌组织中,ACL高表达率为62.2%(51例/82例),ACL低表达率为37.8%(31例/82例)。ACL蛋白水平与年龄、组织学分级、肿瘤大小FIGO分期、组织类型、SREBP-1表达均无显著相关(p>0.05)4.ACL及p-ACL蛋白表达对EOC患者预后的影响4.1单因素生存分析中各临床病理特征对EOC患者预后的影响在82例上皮性卵巢癌组织中,p-ACL(?)高表达的患者中位生存期较低表达患者的中位生存期显著缩短,差异具有统计学意义(p<0.05)。在其他单因素生存分析中,年龄<60岁、高分化者、Ⅰ-Ⅱ期患者中位生存期优于年龄≥60岁、低分化者、Ⅲ-Ⅳ期患者(p<0.05)。其他因素如ACL表达、肿瘤大小、组织类型、SREBP-1表达对预后无明显影响(p>0.05)4.2COX回归模型分析EOC的独立预后因素将单因素分析中与患者生存时间相关的各种因素(p-ACL表达、年龄、组织学分级和FIGO分期),纳入COX回归模型进行多因素分析。结果显示,年龄(p=0.001)和FIGO分期(p=0.031)是上皮性卵巢癌的独立预后因素,其相对危险度(risk ratio, RR)分别是3.189(95%CI,1.658-6.134)和9.089(95%CI,1.224-67.500)；而组织学分级和p-ACL表达均不是上皮性卵巢癌的独立预后因素。结论：1.ACL在EOC组织中表达升高且活化增强,其活性形式p-ACL表达与组织学分级和FIGO分期呈正相关,表明ACL在EOC发生、发展中具有重要作用。2.EOC组织中p-ACL高表达患者的生存期较其低表达患者的生存期明显缩短,表明p-ACL表达水平,即ACL的活化程度有可能成为评估EOC患者生存期的分子指标。第二部分靶向沉默ACL表达对人卵巢癌细胞系生物学行为的影响研究目的：通过RNAi抑制卵巢癌细胞系A2780和OVCAR3中ACL的表达,观察靶向降调ACL表达对卵巢癌细胞生物学特性的影响,探讨ACL在卵巢癌分子发病中的作用机制,为卵巢癌的基因治疗提供新的思路和手段。资料与方法：设计并体外化学合成ACL序列特异性双链RNA,在脂质体(LipofectamineTM2000)介导下转染人卵巢癌细胞系A2780和OVCAR3。采用Western blot方法检测ACL-siRNAs转染后A2780和OVCAR3细胞中ACL蛋白表达的变化,筛选出抑制作用最强的ACL-siRNA.四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测ACL-siRNA转染对A2780和OVCAR3细胞增殖的影响；流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布；Transwell细胞侵袭实验分析转染后细胞体外侵袭能力的变化。结果：1. ACL-siRNAs转染及A2780和OVCAR3细胞中ACL的表达。通过脂质体(LipofectamineTM2000)将ACL-siRNAs及control siRNA(对照组)转染入卵巢癌A2780和OVCAR3细胞,于转染后72h Western blot法检测细胞中ACL蛋白表达水平,结果表明两种ACL-siRNAs (siACL-1和siACL-2)均可有效抑制ACL表达,具有统计学意义(p<0.05),其中siACL-1的抑制作用较强。2.转染ACL-siRNA对A2780和OVCAR3细胞的生长抑制作用。四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测转染后24、48、72、96h ACL-siRNA(采用si ACL-1)对卵巢癌A2780和OVCAR3细胞的生长抑制作用,结果显示,转染后48h、72h、96h siACL-1可明显抑制细胞的增殖,与对照组相比具有统计学意义(p<0.05)。转染后48、72、96hsiACL-1对A2780细胞的生长抑制率分别为(19.3±1.8)%,(21.5±2.2)%和(19.1±2.1)%,对OVCAR3细胞的生长抑制率分别为(13.7±1.1)%,(14.3±1.3)%和(7.1±0.8)%。3.转染ACL-siRNA对A2780和OVCAR3细胞周期的影响。流式细胞术检测转染ACL-siRNA(采用siACL-1)对A2780和OVCAR3细胞细胞周期的影响,结果显示,转染后72h,A2780和OVCAR3细胞的生长周期较对照组明显停滞于S期(p<0.05),各期所占比例分别为：A2780细胞对照组：G1,66.86%; S,29.01%; G2-M,4.13%; A2780细胞siACL-1组：G1,89.11%；S,6.76%；G2-M,4.14%。OVCAR3细胞对照组：G1,64.53%；S,25.54%；G2-M,9.92%； OVCAR3细胞siACL-1组：G1,84.01%；S,10.12%；G2-M,5.86%.4.转染ACL-siRNA对A2780和OVCAR3细胞体外侵袭力的影响。Transwell侵袭实验检测转染ACL.siRNA(采用siACL-1)对A2780和OVCAR3细胞侵袭力的影响,结果显示,转染siACL-1后,每高倍视野A2780细胞/OVCAR3细胞穿过人工基底膜的细胞数目与对照组相比均无显著差异(p>0.05)结论：ACL-siRNAs介导的RNAi能特异性抑制ACL基因的表达。RNAi降调ACL表达可抑制卵巢癌A2780和OVCAR3细胞增殖,并可诱导细胞周期阻滞,ACL有可能成为卵巢癌基因治疗的新靶点。