按照联合国的标准，60岁以上的人口超过10﹪就进入了老龄化社会，2005年统计，中国60岁以上人口是1.44亿，占全国人口的11﹪。因此，中国已经进入了老龄化社会。众所周知，老年人由于身体组织结构逐步老化，器官功能障碍，身体抵抗力减弱，活动度降低以及协同功能丧失等多种原因，容易发生老年病如老年性精神病、老年性痴呆、老年性耳聋、肿瘤、高血压、心血管疾病等；而且老年人的患病率和患病时间平均是一般人的2-3倍。如何减少老年人的发病率和提高老年人的生活质量，是目前中国面临的一个巨大挑战。这个问题的解决在依靠政府重视，增加资金投入的同时，也离不开衰老的相关研究。 近十几年来，衰老机制的研究是当今生命科学研究的一个热点领域，也取得了一些进展。目前成熟的假说有遗传决定学说、氧化损失学说(即自由基一线粒体理论)、衰老分化障碍学说(dys-differentiation hypothesis ofaging)、端粒一端粒酶学说、衰老基因学说<[1-4]>等等。衰老机制的探讨有助于老年性疾病的诊断和治疗，也为预防老年病提供重要的依据。 既往的衰老机制研究从遗传角度考虑较多，表观遗传学(epigenetic)是与遗传学(genetic)相对应的概念。遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等；而表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，如DNA甲基化和染色质构象变化等。随着2001年2月15日人类基因组全序列草图的基本完成，人类表基因组计划在2003年正式启动，该计划目的是绘制DNA上所有的甲基化位点，建立控制基因活性的主要化学变化图谱。这个联盟已经完成了与组织相容性复合物相关的1，000，000个甲基化标签，发现6号染色体有一部分与许多疾病相关。这是世界上首项针对控制人类基因“开”和“关”的主要成分进行的图谱绘制工作，将有助于科学家建立人类遗传、疾病和环境之间的关键联系<[5]>。关于表遗传调节的一种最主要形式是DNA上胞嘧啶的甲基化，从而形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。现在已经清楚表明DNA甲基化在基因沉默、X染色体灭活、遗传印记以及胚胎发育过程等方面起关键作用。有关DNA甲基化与肿瘤的关系研究在近些年来有多种发现：肿瘤组织整体基因组低甲基化和抑癌基因的高甲基化相伴随；DNA甲基化参与基因的表达调控，启动子区高甲基化抑制基因转录、低甲基化使基因过表达等等，这些为临床诊断和治疗肿瘤开辟了新的天地，例如通过去甲基化药物降低抑癌基因启动子区的高甲基化来治疗肿瘤已经广泛用于临床。对于不同肿瘤如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、结肠癌等等与DNA甲基化之间的关系研究已经很多，但是衰老与DNA甲基化的关系研究，在国外处于刚起步状态，国内研究就更少。基因组甲基化修饰是衰老的原因还是衰老的结果?甲基化修饰对衰老的作用是通过什么样的途径实现的?这种作用是间接还是直接的呢?这些问题都有待于深入探讨。依据1965年HarmanD提出的自由基理论：随龄体内线粒体产生自由基增多，所致细胞和组织损伤增多，而DNA修复能力却逐步减弱<[6]>，有关氧化应激与衰老关系的研究逐步增加。目前最得到认可的体外细胞衰老模型常用H<,2>O<,2>诱导人二倍体成纤维细胞来获得<[7]>。在氧化应激致衰老过程中，基因P66参与并起着非常重要的作用，P66是近几年才发现的长寿基因，它参与调节生长，在ROS信号反应过程中，是一个很重要的接合蛋白。有研究发现p66小鼠对抗氧化应激的能力增强，且寿龄比野生型小鼠延长30﹪；P66。可以诱导永久性细胞周期停滞<[8]>。基因P66在衰老过程的表达变化，报导结果不一。而胰岛素样生长因子2(IGF2)是目前发现的为数不多的印记基因之一，对胚胎和个体的生长发育有重要作用，近年发现许多遗传病尤其恶性肿瘤中都存在该基因的印记丢失所致的IGF2高表达现象，这些基因随龄表达如何改变，启动子区甲基化的改变以及二者之间的关系?均有待于进一步研究。 本研究旨在探讨细胞复制性衰老及氧化应激诱导(过氧化氢染毒)的衰老与DNA甲基化的关系，主要内容有：细胞衰老过程中整体DNA甲基化改变、衰老相关基因P66、印记基因IGF<,2>的启动子区甲基化的改变及其随龄mRNA表达变化、DNMT1 mRNA表达及蛋白改变；不同剂量H<,2>O<,2>刺激细胞后，细胞上述指标的影响。方法一、H<,2>O<,2>染毒剂量的确定培养人胚肺成纤维细胞(HPF)细胞，待细胞贴壁24h后，换无血清培养基，使用不同浓度H<,2>O<,2>分别刺激细胞2h，用CCK-8试剂法分析细胞的增殖功能和毒性作用，为后续实验短期染毒确定低、中、高三个染毒剂量。 结论 一、成功建立细胞衰老模型，确定衰老条件和标准，为后续衰老机制研究提供基础。10μM、100μM和200μM H<,2>O<,2>短期染毒细胞后，没有改变细胞寿龄，但影响不同年龄阶段的细胞生长增殖速度。 二、衰老基因P66，其mRNA表达可作为判断衰老的一个生物学指标指标。 三、正常细胞衰老过程中，整体基因组甲基化水平随龄逐渐降低，H<,2>O<,2>短期染毒后，细胞整体基因组甲基化有不同程度下降。DNA甲基化部分参与基因表达调控，P66。基因mRNA表达变化与启动子甲基化修饰相关性不大，而IGF2 mRNA表达量与启动子区甲基化水平呈负相关。H<,2>O<,2>染毒细胞后，在一定程度上影响两个基因启动子区甲基化修饰。