论文部分内容阅读
背景结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤。现在肿瘤靶向治疗受到人们的关注,但单独的靶向治疗效果有限,因此我们想要找到一种联合的治疗方法。PD-1及其配体PD-L1是一对重要的免疫抑制分子,以PD-1为治疗靶点的免疫调节对抗肿瘤、提高患者生存率有极其重要的意义。在研究里表明,通过抑制Stat3进而能够抑制PD-L1的表达,Nifuroxazide是一种肠道抑菌药,在本项研究中发现,Nifuroxazide能够抑制Stat3的表达。减毒沙门氏菌已经被证明能够作为基因治疗的有效载体。因此,我们设想利用减毒沙门氏菌运载PD-1-siRNA联合Nifuroxazide作为治疗结肠癌的一种新型方法。目的探索减毒沙门氏菌运载PD-1-siRNA联合Nifuroxazide抗结肠癌作用及机制研究方法1.细胞实验将培养好的CT-26细胞进行6孔板均匀铺板,放置37°C培养进行培养24h后,拿出来进行加药,其中对照组加入PBS、DMSO,其它四孔分别加入不同浓度的Nifuroxazide,而后,放入培养箱进行孵育,分别在24h、48h进行显微镜拍摄;使用CCK8对CT-26细胞活力进行测定;使用细胞迁移实验检测一下药物Nifuroxazide对细胞迁移是否有影响;使用Western blot来进一步检测与细胞凋亡、增殖、迁移等相关蛋白的表达。2.动物实验把培育好的的CT-26细胞使用注射器注入小鼠皮下,建造荷瘤小鼠模型。在小鼠建模成功后第8天,对小鼠进行分组,分为PBS组、Scrmble组、Nifuroxazide组、PD-1-siRNA组、PD-1-siRNA联合Nifuroxazide组,每天给予PBS(100ul),Nifuroxazide(2mg/只小鼠),分别在治疗第一天和第七天进行减毒沙门氏菌4×10~5CFU/ML治疗,每天进行小鼠出瘤率、肿瘤生长大小和生存周期的统计,用Western blot的方法检测肿瘤组织中Cleaved Caspase 3、Stat3、MMP2、CD4、CD8等相关蛋白的表达,使用HE染色法观察不同治疗组中肿瘤组织形态的变化;通过免疫组织化学的方法和TUNEL凋亡检测小鼠肿瘤组织中免疫细胞和凋亡细胞的表达水平;通过FACS方法检测脾脏中CD4~+T、CD8~+T、NK细胞所占比例。结果1.Nifuroxazide能够抑制CT-26细胞的增长,并且随浓度的增高,抑制作用增强。2.Nifuroxazide作用于CT-26细胞后,能够影响增殖、凋亡相关蛋白的表达。3.动物实验HE染色结果显示,与模型组相比,治疗组均出现不同程度的细胞碎片,联合组最为明显。4.动物实验Western结果显示,与模型组相比,联合组的CD4、CD8蛋白表达明显增高。5.动物实验FACS(流式细胞术)检测结果显示,联合组脾脏中CD4~+T、CD8~+ T细胞,NK1.1细胞所占比例在各实验中表达最高。结论1.Nifuroxazide能够抑制CT-26细胞的增殖和迁移。2.联合治疗方法可以抑制结肠癌小鼠的肿瘤生长,而且提高了小鼠生存率。3.联合治疗组明显的提高了荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫。