前言：肺动脉高压是一种的心血管领域常见疾病,虽然肺动脉高压发生的病因不同,但其临床症状和病理改变却非常相似。临床表现为肺血管阻力持续增加、肺动脉压力升高,最终导致右心功能衰竭,甚至病人死亡。主要的病理改变是肺动脉收缩、肺血管构型重建、肺血管内微血栓形成和炎症等。其中肺血管构型重建是肺动脉高压发生的主要环节,以肺血管内皮功能障碍、平滑肌细胞增殖和细胞外基质明显增加为主要特征。　　 骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一种细胞外基质蛋白,广泛分布于骨、肾、肌肉、膀胱等多种组织中。自然杀伤细胞、骨细胞、破骨细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、多种肿瘤细胞及不同成熟阶段的成骨细胞均能合成和分泌OPN蛋白。OPN作为一种多功能分子,介导了细胞的趋化、聚集、黏附、增殖和迁移,参与了一些慢性炎症和心血管疾病的发生。例如,OPN在肺部疾病中广泛表达,参与调节肺结核肉芽肿的生成、参与特发性肺纤维化的发病及恶性肿瘤的转移,对肺部这些疾病有诊断及潜在治疗意义。但是目前OPN在肺动脉高压发生机制中的作用尚无明确报道。　　 近年来,5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的转运体(serotonin transporter,SERT)被证明是PAH发生发展的关键因素,因此,关于选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitor,SSRI)对PAH的预防和治疗作用日益受到关注。氟西汀是SSRI的一种,我们的前期工作已经证明氟西汀具有抗肺动脉高压的作用,但是氟西汀对肺血管重构和炎症的抑制作用是否与OPN的调节有关,目前尚无报道。因此,本实验拟用MCT诱导的大鼠肺动脉高压模型,对OPN在氟西汀抗肺动脉高压中的作用进行研究。　　 材料与方法：　　 一、建立MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型体重180±10g的雄性Wistar大鼠60只,随机分4组:对照组(control group)、野百合碱模型组(MCT group)、氟西汀低剂量处理组(MCT+F2 group)和氟西汀高剂量处理组(MCT+F10 group)。模型组和处理组的大鼠一次性腹腔注射野百合碱(monocrotaline,MCT)60mg/kg,对照组一次性腹腔注射等体积的乙醇与生理盐水(1∶4)混合液。MCT+F2组和MCT+F10组大鼠每天分别给予氟西汀2mg/kg和10mg/kg灌胃,对照组和MCT组大鼠每天分别给予等体积的蒸馏水灌胃。各组大鼠常规饲养21天。　　 二、大鼠肺动脉压、右心室肥厚指数检测第22天,用3％戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔注射,麻醉后,剥离右颈动静脉,将充满肝素的PV-I聚乙烯导管(尖端弯曲)经右颈静脉插入右心室,让其随血液进入肺动脉,并通过P23ID压刀换能器连接多导生理记录仪(日本光电),测量并记录肺动脉压,同法将导管插入右颈动脉,测体循环压。　　 将大鼠处死取出心脏,仔细分离右心室(right ventricle,RV)和左心室+室间隔(left ventricle and septum,LV+S),滤纸吸水后,分别称量RV和LV+S的重量,以右心指数(right ventricular index,RVI)作为右心肥厚的评价指标,公式如下:RVI=RV/LV+S。　　 三、肺组织形态学及肺血管重构检测取大鼠右肺下叶固定,HE染色。在光学显微镜下对肺血管中膜厚度和肺血管壁面积进行测量分析。分别选择各组直径100～200μm的肺动脉和＜80μm的肺小动脉,测量血管外径、内径,用肺血管中膜厚度百分比评价血管的构型重建,公式如下:Medial wall thickness(％):External diameter-Internal diameter/External diameter×100％。　　 四、应用ELISA方法检测血浆中OPN蛋白的浓度①提取血浆；②ELISA操作步骤参照说明书。　　 五、应用Wlestern Blot检测蛋白在肺组织中的表达:SERT、p-ERK1/2、OPN、MIP-1β、MMP2/TIMP2①大鼠肺组织总蛋白提取；②SDS-PAGE电泳:确定凝胶的体积和浓度,根据蛋白分子量配不同浓度的分离胶；③转膜及封闭:用半干转转膜仪按负极到正极的顺序依次放置海绵、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵,去除每层间气泡,盖好盖子,接通电源,根据分子量决定转膜时间;将PVDF膜放入封闭液中,室温孵育1小时；④抗体孵育；⑤ECL显色⑥半定量分析。　　 六、应用免疫组化检测肺组织中OPN、MIP-1β的表达参照SP法和DAB试剂盒说明书操作;不同的抗体抗原修复时间、抗体浓度选择不同。　　 结果：　　 一、氟西汀抗MCT诱导的大鼠肺动脉高压对照组大鼠平均肺动脉压力为15±2.8mmHg,而MCT组大鼠平均肺动脉压明显增加至31.5±8.5mmHg(P＜0.01,vs control);与MCT组相比较,MCT+F2组的肺动脉压力无显著差异,而在MCT+F10组,平均肺动脉压力明显降低至23.8±2.1mmHg(P＜0.05,vs MCT)。　　 对照组的右心肥厚指数为31.0％±2.7％,MCT组则为56.3％±14.6％(P＜0.01,vs control)。与MCT组相比,氟西汀剂量依赖性地降低了右心肥厚指数:MCT+F2组的右心肥厚指数为50.9％±5.9％,与MCT组相比,无明显差异;MCT+F10组为40.8％±0.7％(P＜0.05,vs MCT),与MCT组相比,有明显的统计学意义。　　 在MCT组,平均肺动脉压力和右心肥厚指数变化一致,且明显升高,这提示MCT诱导肺动脉高压大鼠病理模型成功建立。氟西汀剂量依赖性的降低了平均肺动脉压力和右心肥厚指数,且氟西汀10mg/kg处理作用明显,提示氟西汀具有抗肺动脉高压的作用。　　 二、氟西汀对MCT诱导肺动脉高压大鼠肺组织形态学影响大鼠肺组织切片HE染色结果显示,对照组大鼠肺动脉管壁薄、管腔大,平滑肌细胞排列规则均匀,内皮细胞完整连续。MCT组大鼠肺组织结构不清,肺动脉管壁明显增厚,血管平滑肌细胞增生肥大,管腔明显变小,甚至肺小动脉形成管腔闭锁,并且肺血管周围有大量炎性细胞浸润。与MCT组比较,MCT+F2组形态学上没有明显改观,而MCT+F10组肺组织结构清楚,肺血管管壁变薄、平滑肌细胞排列较规则,血管周围炎性细胞减少。以上结果都表明MCT可诱发明显的肺血管构型重建和炎症,氟西汀10mg/kg明显抑制了MCT引起的肺血管构型重建和炎症。　　 与对照组相比,MCT诱发肺动脉(直径100～200μm)血管壁明显肌化、增厚,肺动脉中膜厚度百分比由34.9％±8.8％提高到45.8％±5.2％(P＜0.01,vscontrol)。而氟西汀10mg/kg可显著降低MCT引起的肺血管壁增厚,使肺动脉中膜厚度百分比降至37.4％±3.8％(P＜0.05,vs MCT)。　　 与对照组相比,MCT组肺小动脉(直径＜80μm)血管壁明显增厚,甚至形成管腔闭锁,肺小动脉中膜厚度百分比由32.5％±2.1％提高到96.7％±6.4％(P＜0.001,vs control)。而氟西汀10mg/kg可显著降低MCT引起的肺肺小动脉的构型重建,使肺小动脉壁中膜厚度百分比降至51.7％±2.3％(P＜0.01,vs MCT)。　　 三、氟西汀对MCT诱导肺动脉高压大鼠血浆中OPN蛋白水平的影响用ELISA方法检测大鼠血浆中OPN蛋白表达的水平。结果显示,MCT诱导肺动脉高压大鼠血浆中的OPN蛋白浓度明显升高,由对照组的26.0±6.0ng/ml上升至MCT组的35.7±10ng/ml(P＜0.01,vs control),OPN蛋白浓度在MCT+F2组为35.0±10ng/ml,而在MCT+F10组却明显降低,为29.2±5.0ng/ml(P＜0.01,vsMCT)。　　 相关性分析的结果显示,血浆中OPN的蛋白水平分别与肺动脉压力、肺小动脉中膜厚度百分比和肺小动脉血管壁面积呈正相关,相关系数r分别为0.613,0.7396和0.6383,均有统计学意义,P＜0.05。　　 四、氟西汀对MCT诱导肺动脉高压大鼠肺组织中SERT表达及ERK1/2磷酸化的影响用westernblotting方法检测肺组织中SERT蛋白表达。结果表明,与对照组相比较,MCT组中SERT蛋白表达明显增高(2.15±0.60 vs0.59±0.10,P＜0.01)。MCT组相比,氟西汀2mg/kg对SERT表达的影响无统计学意义(1.94±0.50 vs.2.15±0.60,F＞0.05),而氟西汀10mg/kg可以明显的抑制SEPT的增加,使蛋白水平下降(1.47±0.30 vs2.15±0.60;P＜0.05,vs MCT)。　　 用western blotting方法检测肺组织中ERK1/2的磷酸化。结果表明,与对照组相比较,MCT组的肺组织中ERK1/2磷酸化水平明显增高(0.84±0.14 vs0.25±0.06;P＜0.01)。氟西汀剂量依赖性地抑制ERK1/2磷酸化水平,氟西汀2mg/kg使ERK1/2磷酸化水平下降,但无统计学差异(0.52±0.24 vs0.84±0.14;P＞0.05,vsMCT);而氟西汀10mg/kg可以明显抑制MCT诱导的ERK1/2的磷酸化(0.44±0.13vs0.84±0.14;P＜0.05,vs MCT)。　　 五、氟西汀对MCT诱导肺动脉高压大鼠肺组织中OPN、MIP-1β蛋白表达的影响用western blotting方法检测肺组织中OPN蛋白结果表明,与对照组相比较,MCT组OPN蛋白的表达明显增高(0.93±0.16 vs0.30±0.09,P＜0.01,MCT vscontrol)。氟西汀剂量依赖性地抑制OPN蛋白的表达(0.68±0.19 vs0.93±0.16,P＜0.05,MCT+F2 vs MCT;0.48±0.11 vs0.93±0.16,P＜0.01,MCT+F10 vs MCT),差异具有统计学意义。　　 用免疫组织化学方法检测大鼠肺组织中OPN蛋白的表达,与对照组相比,MCT可以明显刺激OPN的蛋白表达,镜下肺动脉血管壁、肺泡壁细胞和肺泡内巨噬细胞上都有明显的棕黄色阳性表达。与MCT组相比,MCT+F2组无明显改变,而MCT+F10组的大鼠肺组织切片中OPN阳性表达明显减少,提示氟西汀10mg/kg可抑制OPN在肺组织中的表达。　　 用western blotting方法检测肺组织中MIP-1β蛋白结果表明,与对照组相比较,MCT组MIP-1β蛋白的表达明显增高(0.80±0.20 vs0.05±0.01;P＜0.01,vscontrol)。氟西汀剂量依赖性地抑制MIP-1β蛋白的表达,氟西汀10mg/kg可以明显抑制MIP-1β蛋白的表达(0.49±0.10 vs0.80±0.20;P＜0.05,vs MCT),差异具有统计学意义。　　 用免疫组织化学方法检测大鼠肺组织中MIP-1β蛋白的表达,与对照组相比,MCT组MIP-1β的蛋白表达明显增加,镜下伴有炎性细胞浸润的肺组织有明显的棕黄色阳性表达。与MCT组相比,MCT+F2组无明显改变,而MCT+F10组的大鼠肺组织切片中MIP-1β阳性表达明显减少,提示氟西汀10mg/kg可明显减轻MCT诱发肺组织的炎性改变。　　 六、氟西汀对MCT诱导肺动脉高压大鼠肺组织中MMP-2/TIMP-2蛋白表达的影响MMP-2/TIMP-2比例失衡在组织重构中起到了重要的作用。Western blotting检测结果表明,与对照组相比较,MCT组MMP-2/TIMP-2比例明显上调(1.68±0.26 vs0.80±0.15;P＜0.01,vs control)。与MCT组相比,氟西汀2mg/kg轻度降低MMP-2/TIMP-2(1.49±0.38 vs1.68±0.26),无明显差异;但氟西汀10mg/kg可以明显抑制MMP-2/TIMP-2上调(1.24±0.26 vs1.68±0.26;P＜0.05,vs MCT),提示氟西汀10mg/kg可明显改善MCT诱发组织重构的改变。　　 结论：　　 1.本研究发现MCT可导致大鼠血浆和肺组织中OPN表达增加,同时OPN的蛋白水平与肺动脉高压相关检测指标呈正相关,表明OPN蛋白参与MCT诱导的大鼠肺动脉高压。　　 2.氟西汀抑制SERT和ERK1/2的磷酸化进而减少OPN的表达,表明氟西汀抗肺动脉高压的作用可能与OPN的下调有关。