一、研究背景和目的　　 肠出血型大肠埃希菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7是一种新现肠道致病菌,能引起人出血性肠炎(Hemorrhagic colitis,HC)、溶血性尿毒综合征(Hemolytic uremic syndrome,HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(Thrombotic thromobocytopenie porpura,TTP)等。　　 EHEC属于产志贺毒素型大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,SVEC),在STEC的O血清型中,0157:H7型是爆发流行常见的血清型,在多个国家都有流行。1993年,美国发生了一次EHEC 0157:H7暴发,涉及到4个州,700余名儿童受感染,其中51例发生了HUS,4例死亡。1996年,日本发生了一起EHEC 0157:H7暴发流行,涉及30多个县市,患者9000余名,死亡9人。1999-2000年,我国苏皖等地发生EHEC 0157:H7大规模暴发流行,患者约2万人,发生急性肾功能衰竭者195人,死亡177人,这次爆发是迄今为止世界上流行规模最大、死亡人数最多、流行时间最长、发病因为最复杂的一次。目前,EHEC 0157:H7的感染呈暴发流行趋势,具有较强的致病性与致死性,已成为全球性的公共卫生问题。　　 EHEC O157:H7感染引起的典型病理特征是肠上皮细胞黏附抹去(attachingand effacing,A/E)损伤,其主要病理学变化表现为细菌与肠上皮细胞紧密黏附,细菌黏附部位的肠上皮细胞骨架发生改变,肠微绒毛肌动蛋白发生去聚化,从而导致微绒毛收缩和脱落。已证实,EHEC和肠致病性大肠杆菌(EnteropathogenicEscherichia coli,EPEC)的主要毒力因子是指包括引起A/E损伤的所有基因,位于染色体肠细胞脱落位点LEE(the locus of enterocyte effacement,LEE)致病岛。espF基因位于LEE第4个操纵子。序列分析表明,不同致病菌中表达的EspF蛋白在核苷酸和氨基酸序列上有差别。EHEC和EPEC的espF基因序列同源性为91％,氨基酸序列同源性为75％,从N端起最初的70个氨基酸同源性为99％,C末端氨基酸最大的区别是EspF在EHEC中有4个脯氨酸重复子,EPEC中有3个。目前,EspF功能的研究多集中于EPEC。它的功能主要有破坏肠上皮细胞的屏障功能,靶向作用于线粒体,启动宿主细胞早期凋亡程序,诱导细胞死亡。　　 近几年,尽管对EPEC中的EspF蛋白功能进行了深入研究,并证实肠屏障的破坏与EspF密切相关,但EspF其他的功能,如诱导细胞死亡、参与AME损伤的机制仍不清楚,与宿主相关蛋白相结合导致信号变化也只是推测。espF基因在EHEC和EPEC中高度同源,但编码的蛋白有差异,并且EPEC和EHEC的黏附部位不同,EPEC黏附于小肠的肠上皮细胞,EHEC黏附于大肠的肠上皮细胞。这说明了EHEC和EPEC对宿主细胞的致病分子机理存在差异。那么,在EHEC 0157:H7中,EspF是否影响细菌的黏附性、参与细胞屏障的破坏以及诱导细胞死亡呢?根据espF基因在EPEC中的研究进展,本研究从EspF的N端功能区分子结构入手,采用重叠延伸OL-PCR(overlap extension PCR,OL-PCR)、同源重组等方法构建EHEC O157:H7 EspF的N端部分序列缺失突变株,并用突变株与野生株分别感染细胞,对其功能比较研究,可望揭示EspF蛋白在EHEC O157:H7感染导致肠上皮细胞产生黏附-抹去损伤中的作用。　　 二、研究方法　　 1.EHEC O157:H7Nal(△espF)突变株的构建 将菌株EHEC O157:H7广州株(菌号:246)接种于LB液体培养基中培养,不断增加萘啶酮酸(Nal)浓度,至Nal终浓度为50μg/ml,诱导出具有萘啶酮酸抗性菌株,命名为EHECO157:H7(Nal)。根据GenBank的espF基因序列(Accession NO.NC_002655)及其上、下游的DNA序列,设计合成两对引物:P1、P2和P3、P4,其中P2和P3的5’端有19bp互补序列,P1、P4分别添加酶切位点XbaI和SacI。以EHECO157:H7全基因组为模板,采用重叠延伸PCR(OL-PcR)法,通过两步PCR获得espF缺陷同源性片段△espF。△espF克隆于pMDT19,构建重组质粒pMDT19-△espF。pMDT19-△espF和自杀质粒pCVD442同时进行双酶切,将目的片段连接到pCVD442,构建重组自杀质粒pCVD442-△espF。后者电穿孔转化于大肠埃希菌SM10,得到重组菌SM10(pCVD442-△espF)。菌株EHEC O157:H7(Nal)与重组菌SM10(pCVD442-△espF)混合,通过滤膜进行接合转移,并用氨苄青霉素和萘啶酮酸进行双抗筛选菌株EHEC O157:H7(pCVD442-△espF),该菌株稀释后涂布于浓度为5～10％的蔗糖平板上,筛选突变株EHEC O157:H7(△espF)。　　 2.野生株与突变株生物学特征比较 野生株和突变株按革兰染色步骤进行染色,光学显微镜观察。在相同培养条件下,在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h分别测野生株和突变株的OD600,以时间为横坐标,OD600的对数为纵坐标绘制各生长曲线。　　 3.细菌黏附实验　　 (1)吉姆萨(Giemsa)染色观察细菌黏附 Lovo细胞进行载玻片爬片后,细菌感染作用于细胞2h,按吉姆萨染色试剂说明进行染色,待干,镜检。　　 (2)涂板计算细菌黏附率过夜培养的野生株、突变株和工程菌DH5 α(阴性对照菌株)重悬于不含抗生素的培养基(DMEM,10％胎牛血清)。Lovo细胞培养于12孔板内,长至单层细胞,约为2X 105cells/孔。以每孔2x107的细菌量接种到培养Lovo细胞的12孔板内(使细胞感染倍数约为100),轻轻晃动培养板混匀。细胞培养板放入培养箱,37℃,5％CO2,1.5-2h。每种细菌接种8个复孔。黏附实验步骤参照先前实验研究所述。为计算黏附于细胞的细菌数,细胞用PBS洗3次,加入150μl的0.5％Triton X-100裂解细胞,孵育8min后,加入100μl PBS,反复吹打吸出样品,每孔样品做梯度稀释后涂布于2个琼脂平板计数菌落数。计算黏附率(黏附率=黏附到细胞的细菌数/初始加到细胞孔的总细菌数×1000‰)。利用SPSS13.0进行单因素方差分析,比较各菌黏附率的平均值差异。　　 4.统计分析处理方法 细菌黏附实验中采用单因素方差分析(One WayANOVA),比较各菌株黏附率的差异。　　 三、结果　　 1.构建了突变株EHEC O157:H7(△espF)OL-PCR扩增出了espF基因缺陷同源性片段△espF,大小约为1762bp,测序并与原espF基因序列比对,片段△espF缺失了162bp。利用萘啶酮酸和氨苄青霉素双抗性获得了菌株EHECO157:H7(pCVD442-△espF),取该菌株的菌液为模板,P1、P4引物PCR扩增可见有两条片段,大小分别为1924bp和1762bp。菌株EHEC O157:H7(pCVD442-△espF)经过蔗糖筛选,获得同源重组菌株EHEC O157:H7(△espt；),菌液PCR验证,可见到一条片段,大小约为1762bp。测序证实,菌株EHEC O157:HT(△espF)的espF基因缺失162bp。　　 2.野生株和突变株的生物学性状 在革兰染色中,野生株和突变株均为革兰染色阴性,短小棒状杆菌。根据所测的OD600绘制生长曲线,野生株和突变株的生长曲线趋势基本一致。　　 3.细菌黏附实验 吉姆萨染色可见野生株黏附于细胞的数量较多,突变株较少。涂板菌落计算细菌的黏附率,单因素方差分析结果显示,菌株间的黏附率比较.P<0.001,具有统计学意义。野生株的平均黏附率是18.128±3.159‰,突变株的平均黏附率是6.756±1.297‰。　　 四、结论　　 1.选择EHEC O157:H7广州株(菌号:246)作为始发株,采用OL-PCR扩增出espF基因缺陷同源性片段△espF,与espF原基因序列相比,前者缺失了162bp碱基,缺失的位置位于EHEC OP157:H7全基因组中的4659104-4659265,位于EspF蛋白氨基酸序列中的N端第15-68个氨基酸残基,因此,本研究破坏了EspF蛋白N端的功能区。　　 2.利用自杀性质粒pCVD442介导同源重组,通过蔗糖平板筛选同源重组菌株,PCR、Amp抗性和测序证明了质粒携带的突变基因和宿主染色体上的野生型发生完全同源重组。因此,本实验成功获得了突变株EHEC O157:H7(△espF)。突变株的构建为进一步研究EspF蛋白在肠上皮细胞黏附.抹去损伤中的作用打下坚实基础。　　 3.espF基因的缺失不影响EHEC O157:H7的形态和生长规律。　　 4.espF基因的缺失减弱了细菌对细胞的黏附能力。