适用于食品中抗生素残留快速筛查的比色适配体传感器研究

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抗生素作为治疗各种非病毒感染的药物已经广泛应用于兽医临床治疗中,然而其过量和不恰当的使用导致了它在泌乳动物乳汁中残留。众所周知,抗生素会通过食物链在人体内不断富集累积,使人体对抗生素产生抗药性从而危害人们的健康。因此,检测食品中的抗生素残留刻不容缓。但是,食品中的抗生素含量往往特别低,一般都是痕量级别(ng mL-1)存在,同时食品中存在严重的基质干扰,所以想要实现现场检测极其困难。比色适配体传感器是一种灵敏度高、选择性好、操作简便以及检测结果肉眼可视的光谱分析方法,近些年来迅速发展成为食品安全现场检测的主要方法之一。本文基于抗生素适配体对抗生素的特异性识别,利用Au纳米颗粒修饰的SiO2、酶联聚合物、Exo I、催化链自组装(CHA)以及环状链置换聚合反应(CSDP)辅助的目标物循环等进行信号放大,构建了一系列高灵敏的比色探针。相比于目前的一些适配体传感器,开发的上述方法降低了实验成本、缩短了检测时间、提高了检测的灵敏度,为现场检测食品中抗生素残留提供了广阔的应用前景。本研究主要从如下四个方面展开:1.基于磁性单链DNA结合蛋白标记复合探针的比色适配体方法来检测食品中的氯霉素本章基于磁性单链DNA结合蛋白(SSB)标记的复合探针,开发了一种比色方法来检测食品中的小分子物质。首先,通过将SSB修饰到金磁微粒(Au MNPs)上合成捕获探针(Au MNPs-SSB),适配体(Apt)和辣根过氧化物酶(HRP)共标记的SiO2@Au核壳结构来合成信号探针(Apt-SiO2@Au-HRP);然后,复合探针通过SSB和Apt之间特异的亲和性结合所形成。当目标物(氯霉素)存在于时,由于适配体与氯霉素之间的亲和力大于其与SSB之间的亲和力,使CAP/Apt-SiO2@Au-HRP脱落到上清液中,可以有效地催化TMB-H2O2体系发生颜色变化。氯霉素浓度在0.05–100 ng mL-1之间得到了良好的线性范围,最低检测限为0.02 ng mL-1(S/N=3)。同时,该方法应用到检测牛奶中的氯霉素含量并且实验结果与商业化的ELISA一致。2.基于多孔硅-酶联聚合物适配体探针和核酸外切酶辅助目标物循环进行信号放大的POCT比色适配体传感器来检测链霉素本章基于多孔SiO2微粒(孔径大约200 nm)-酶联聚合物(PowerVisionTM,PV)探针和Exo I辅助的目标物循环,开发了一种POCT比色适配体传感器来检测链霉素(STR)。探针构建过程如下:将单链DNA结合蛋白修饰到SiO2微粒上作为捕获探针(P-SiO2-SSB),Au NPs和适配体(Apt)共修饰的PV作为纳米示踪剂(Apt-Au-PV)。当STR和Exo I存在的时候,纳米示踪剂将与目标物STR结合形成复合物(STR/Apt-Au-PV)。随后,Exo I可以进一步消化复合物上的适配体,使目标物重新释放出来进行新一轮的循环。另外,树枝状的PV上含有大量的HRP酶可以有效地催化H2O2-TMB系统发生颜色变化且实验结果肉眼可视。该适配体传感器展现出低的检测限1 pg mL-1(S/N=3)。此外,开发的该方法可能为食品安全现场检测提供了良好的发展前景。3.基于模拟酶结合Loop-DNA探针和CHA辅助目标物循环进行信号放大的比色适配体传感器来检测牛奶中的抗生素残留本章基于磁性loop-DNA-NMOF-Pt(m-L-DNA)探针和催化发卡自组装(CHA)辅助目标物循环进行信号放大,开发了一种模拟酶比色适配体传感器来检测牛奶中的卡那霉素(KANA)。M-L-DNA探针的构建基于两部分的杂交反应:一是发卡DNA H1(包含适配体序列)固定在磁珠上形成m-H1;另外一部分是将信号DNA(sDNA,与H1部分互补)标记到纳米Fe-MIL-88NH2-Pt上作为纳米示踪剂(NMOF-Pt-sDNA)。在KANA和另外一个发卡DNA H2(与H1完全互补)存在时,m-L-DNA探针被破坏形成m-H1/KANA中间产物。此时,CHA反应被触发生成更加稳定的双链(m-H1-H2)结构,同时将目标物KANA释放出来进行循环反应。因此,大量的模拟酶NMOF-Pt-sDNA可以协同催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺发生颜色变化。该适配体传感器在30分钟之内对检测牛奶中KANA展现出高的选择性和灵敏度,检测限为0.2 pg mL-1。该方法可以方便的扩展到现场筛查食品中其他抗生素,仅仅只需要改变探针上的碱基序列。4.基于DNAzyme标记Fe-MIL-88-Pt为新型过氧化物酶标签和目标物触发CSDP循环多重信号放大的比色适配体传感器来检测抗生素本章基于DNAzyme标记Fe-MIL-88-Pt作为新型模拟酶信号标签和目标物触发环状链-置换聚合反应(CSDP)来进行信号放大,开发了一种超灵敏的比色适配体传感器来检测抗生素,本章以氯霉素(CAP)为目标物模型。该体系由部分互补的两个探针构成:一个是将包含适配体序列的发卡DNA固定在磁珠上形成的捕获探针(MB-cDNA),另一个是将与cDNA部分互补的单链DNAzyme(G-quadruplex/Hemin)固定在Pt NPs功能化的Fe-MIL-88上形成的信号标签(MIL-88-Pt-DNAzyme)。该标签上的所有元件包括MIL-88,Pt和DNAzyme均可作为过氧化物模拟酶来三重催化TMB氧化成蓝色产物oxTMB。因此,即使少量信号标签的存在也可以产生肉眼可见的颜色变化。在目标物和引物的存在下,cDNA的环状部分被打开形成cDNA/CAP中间产物,致使引物可以与cDNA上暴露出来的序列进行杂交,在DNA聚合酶的作用下引发目标物辅助的CSDP循环。然后,大量的信号标签被释放到上清液中来催化TMB发生颜色变化。该方法的最低检测限为0.03 pM。此外,该方法可以产生肉眼可视的信号方便了现场检测。
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