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第一部分：上调Periostin基因对GC细胞增殖的影响目的：细胞增殖是肿瘤发生发展的一个基本生物学过程。本部分拟研究Periostin表达增强对GC（胃癌SGC-7901细胞）细胞增殖的影响。方法：以人Periostin cDNA （2340bp; GenBank NM001135934）克隆为模板对人Periostin基因片段进行扩增，将Periostin全长序列插入到真核表达载体pcDNA3.1（+）中得到Periostin表达质粒，经测序证实重组质粒构建成功。利用Lipofectamine2000把Periostin重组质粒转染至SGC-7901细胞中。转染两天后，细胞中加入600μg/mL的G418，筛选阳性克隆。转染后的细胞持续在600μg/mL的G418中进行筛选扩增约2-3周。提取稳定转染人Periostin SGC-7901细胞总蛋白，应用Western blot法测定Periostin的蛋白表达水平，确定Periostin过表达SGC-7901克隆并用于细胞增殖实验。将稳转人Periostin的SGC-7901细胞、稳转空载体的对照细胞以及未转染的SGC-7901细胞按照每孔1.5×103细胞的密度接种入96孔板中，培养五天，每天均收集细胞应用MTT法进行细胞活性检测。连续变量用均数±标准差表示，两样本均数比较采用student t检验，多样本均数的比较以及组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。分类变量以及样本率的比较采用Tukey post-hoc检验。结果：用PCR技术扩增Periostin全长cDNA，得到一条符合预期大小（2340bp）的DNA条带，将其纯化回收后与pcDNA3.1（+）载体连接，得到pcDNA3.1-Periostin重组质粒。该重组质粒经测序证实Periostin全长序列被成功插入pcDNA3.1（+）表达载体。应用Western blot法检测转染pcDNA3.1空载体和转染Periostin真核表达质粒的SGC-7901细胞中Periostin蛋白表达水平。结果发现，转染Periostin表达质粒细胞的Periostin蛋白水平比转染空载体对照细胞明显升高，大约增加2.5-4倍，差异有统计意义（P <0.05）。这表明转染该Periostin重组质粒能导致SGC-7901细胞过表达Periostin基因。应用MTT法连续检测5天，比较转染pcDNA3.1空载体和转染Periostin真核表达质粒SGC-7901细胞的增殖能力。结果表明：对照SGC-7901细胞与过表达Periostin细胞的增殖水平相当，无统计学差异（P>0.05）。结论：转染所构建重组质粒可导致Periostin在SGC-7901细胞中过表达；在SGC-7901细胞中（至少在本文检测的细胞系中）过表达Periostin对SGC-7901细胞增殖没有明显影响。第二部分：上调Periostin基因增强GC细胞对p53介导细胞凋亡的抵抗性目的：肿瘤细胞产生耐药性是肿瘤治疗失败的主要原因之一，最终导致肿瘤复发以及死亡。尽管围绕GC耐药机制的研究已有很多进展，然而迄今为止确切的机制尚未完全清楚。本部分拟研究Periostin基因在调控GC化疗敏感性中的作用及机制。方法：将稳转人Periostin的SGC-7901细胞、稳转空载体的对照细胞以及未转染的SGC-7901细胞按照每孔2×104细胞的密度接种入96孔板中，加入不同浓度的顺铂或5-FU处理24小时，应用流式细胞术结合Annexin-v染色法检测细胞凋亡情况。将上述细胞系按照每孔5×105细胞的密度接种入12孔板中，分别应用5μM顺铂或10μM5-FU处理稳转人Periostin SGC-7901细胞和稳转空载体对照细胞24小时，应用Western blot法检测Bax、Bcl-2、细胞色素C、切割型Caspase-3和切割型PARP蛋白表达情况。应用5μM顺铂或10μM5-FU处理稳转人Periostin的SGC-7901细胞、稳转空载体的对照细胞以及未转染的SGC-7901细胞，24小时后收集细胞，应用Western blot法测定p53蛋白表达的情况。应用5μM顺铂或10μM5-FU处理稳转人Periostin的SGC-7901细胞、稳转空载体的对照细胞、未转染的SGC-7901细胞以及共转染Periostin和p53细胞24小时，应用流式细胞术结合Annexin-v染色法检测细胞凋亡情况。应用Western blot法检测稳转人Periostin的SGC-7901细胞、稳转空载体的对照细胞以及未转染的SGC-7901细胞中总Akt和磷酸化Akt的水平。应用Akt特异抑制剂MK-2206（1μM）预处理30分钟，然后应用5μM顺铂或10μM5-FU处理稳转人Periostin的SGC-7901细胞、稳转空载体的对照细胞以及未转染的SGC-7901细胞，最后应用Western blot法检测p53表达情况并应用流式细胞术结合Annexin-v染色法检测细胞凋亡情况。结果：顺铂或5-FU可显著诱导SGC-7901细胞发生凋亡，并且这种凋亡诱导效应具有剂量依赖性。与转染空载体SGC-7901细胞相比，Periostin过表达细胞对顺铂或-5-FU诱导凋亡具有显著的抗性（P<0.05）。5μM顺铂或10μM5-FU分别诱导14%和10%的转染空载体细胞发生凋亡，而只能分别引起约8%和6%的Periostin过表达细胞发生凋亡。顺铂或5-FU处理SGC-7901细胞促进细胞色素C由线粒体释放到细胞质中，并且增强Caspase-3和PARP蛋白切割。Periostin过表达可逆转顺铂和5-FU诱导这些蛋白的变化。与转染空载体细胞相比，过表达Periostin导致胞质内细胞色素C、活化型Caspase-3和PARP的蛋白水平明显下降。顺铂和5-FU可诱导SGC-7901细胞Bax蛋白上调而抑制Bcl-2表达。过表达Periostin则可显著降低药物诱导的Bax蛋白表达水平，而增加Bcl-2的表达水平。与未处理对照细胞相比，顺铂和5-FU处理SGC-7901细胞均可诱导p53表达上升，增加约5-6倍（P<0.05）。过表达Periostin可明显抑制顺铂和5-FU诱导的p53表达增加，而转染空载体对p53表达水平没有明显影响。恢复p53表达可逆转Periostin过表达SGC-7901细胞对顺铂和5-FU诱导凋亡的抗性。Periostin过表达可诱导SGC-7901细胞中Akt磷酸化水平明显增加，而对总Akt蛋白水平没有影响。在顺铂或5-FU处理的SGC-7901细胞中，Periostin过表达可显著抑制p53的表达，而应用Akt通路特异抑制剂MK-2206预处理SGC-7901细胞则可逆转Periostin过表达对p53的抑制作用。并且MK-2206预处理SGC-7901细胞则可逆转Periostin过表达诱导的凋亡保护效应。结论：上调Periostin表达可增强SGC-7901细胞对顺铂或5-FU诱导细胞凋亡的抵抗力增强，并引起Bax基因表达下调以及Bcl-2基因表达上调。Periostin过表达可通过激活Akt通路抑制p53的表达，从而增强GC细胞耐药性，因而可作为一个潜在的药物作用靶点。