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研究背景:经皮腔内冠状动脉介入术(percutaneous transluminal coronaryintervention,PCI)是目前冠状动脉粥样硬化性心脏病的主要治疗措施之一,且已发展成为一种较成熟的介入性治疗手段,然而血管成形术后再狭窄(restenosis,RS)的高发生率严重影响了手术远期效果,至今还没有很满意的治疗方法。探讨RS的机制及其新型治疗方法成为心血管药理领域的一大热点与难点。研究表明,缝隙连接(gap junction,GJ)参与了血管平滑肌细胞(vascular smooth musclecells.VSMCs)间的信息传递及其增殖和迁移过程,而VSMCs的增殖和迁移是血管壁重构发生再狭窄的重要因为之一。我们假设缝隙连接蛋白重构可能参与了血管重构和再狭窄的病理过程。
目的:本实验旨在观察慢病毒介导的大鼠Cx43基因沉默后对体外培养VSMCs的Cx43 mRNA和蛋白的表达以及对10%FBS诱导的VSMCs增殖和迁移的影响,为开发新型载基因支架治疗RS的临床前研究奠定理论基础。
方法:观察不同感染复数(MOI分别为0、50、100、150、200)的Cx43-RNAi-LV对10%FBS诱导的VSMCs增殖的影响,MTT比色法测定吸光度值(OD492),绘制细胞生长曲线;细胞划痕法测定细胞迁移距离并计算细胞迁移抑制率;RT-PCR法测定Cx43 mRNA的表达;Western Blotting法检测Cx43蛋白的表达。
结果:MTT法结果显示:与MOI0组比较,Cx43-RNAi-LV(MOI100)组48h时OD值显著性降低(p<0.05)。时间点为48h、72h、96h时,随着MOI的增大,OD值的降低有极显著性差异(p<0.01)。后续实验以MOI为100转染VSMCs48h。而NC-GFP-LV感染组细胞OD值无显著差异,表明Cx43-RNAi-LV对10%FBS诱导的VSMCs增殖具有明显的抑制作用。
细胞划痕法显示:与正常对照组比较,Cx43-RNAi-LV感染组细胞迁移抑制率为37.37%(P<0.01),而NC-GFP-LV感染组细胞迁移距离无显著差异,结果表明Cx43-RNAi-LV对10%FBS诱导的VSMCs迁移具有抑制作用。
RT-PCR和Western Blotting检测结果均显示:Cx43-RNAi-LV感染组Cx43mRNA及其蛋白表达量较NC-GFP-LV感染组和正常对照组明显降低(P<0.01)。
结论:①大鼠Cx43基因RNA干扰慢病毒可有效沉默体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞Cx43 mRNA和蛋白的表达。
②RNA干扰特异性抑制Cx43基因表达后,能显著性抑制体外培养的10%FBS诱导的VSMCs增殖和迁移。为RS的防治方法提供了新的思路和策略。