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目的:本研究以碱性成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）、血管内皮生长因子（VEGF）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等肿瘤相关细胞因子为靶点，在已有免疫筛选获得的纳米抗体（Nanobody，Nb）噬菌体库的基础上，通过在大肠杆菌中重组表达这3种细胞因子的纳米抗体，其中：FGF-2纳米抗体3株、VEGF纳米抗体10株、TNF-α纳米抗体8株，比较各种纳米抗体的抗原结合特性，旨在筛选出高特异性的FGF-2、VEGF和TNF-α纳米抗体。 方法:（1）PCR法扩增NbFGF-2、NbVEGF、NbTNF-α的目的基因，亚克隆至pET-22b或pNCS等表达载体并转化至相应宿主菌中；(2)对纳米抗体工程菌进行表达条件优化，并将其产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化；(3)间接ELISA方法鉴定NbFGF-2、NbVEGF、NbTNF-α的抗原结合特异性；(4)WST-8法验证FGF-2纳米抗体对非小细胞肺癌H1299细胞株的增殖抑制活性。 结果:（1）构建了3个pET-22b-NbFGF-2表达载体，并转化至工程菌E.coil BL21，优化表达条件，发现最佳诱导温度为18℃，IPTG浓度为0.5mM，诱导时间为18h，在此条件下，纳米抗体的最高表达量可以达到1.06mg/L；经Ni-NTA纯化后，NbFGF-2纯度可达85~90%；特异性实验结果表明，3种NbFGF-2只特异性结合FGF-2，与其他相关蛋白的结合能力弱或者不结合；细胞活性实验结果表明，3种NbFGF-2对H1299细胞的增殖均有抑制作用，抑制率15~20%之间，具有剂量依赖性，其中NbFGF-2-2的抑制效果最佳。（2）构建了10个pNCS-NbVEGF，并在工程菌E.coilDH5α中获得表达。经Ni-NTA纯化，蛋白纯度均>80%。特异性实验结果表明，在10株NbVEGF纳米抗体中，NbVEGF-3、NbVEGF-7、NbVEGF-10具有VEGF结合特异性；（3）构建了8个pNCS-NbTNF-α重组质粒，并在工程菌E.coil DH5α中成功表达。经Ni-NTA纯化，蛋白纯度均＞80%。特异性实验结果表明，在8个NbTNF－α纳米抗体中，NbTNF－α-1、NbTNF－α-2、NbTNF－α-3、NbTNF－α-4、NbTNF－α-5具有TNF-α结合特异性。 结论:本研究获得了针对FGF-2、VEGF和TNF-α等3种抗原的21株纳米抗体工程菌，制备了纯度＞80%的纳米抗体，筛选到了多株具有抗原特异性的纳米抗体，为后续抗肿瘤候选药物或诊断试剂研发提供了物质材料。