【摘 要】
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程序性死亡受体1（Programed cell death 1,PD-1）作为表达于T细胞表面的免疫检查点分子之一,通过与其配体-1（ligands of programmed death-1,PD-L1）相互作用进而介导相关抑制信号通路激活,发挥重要的免疫调节及平衡作用。在慢性病毒感染或肿瘤疾病等特殊生理条件下,PD-1/PD-L1信号通路的过度激活可引发机体出现T细胞增殖、活化抑制,以及影响细
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程序性死亡受体1（Programed cell death 1,PD-1）作为表达于T细胞表面的免疫检查点分子之一,通过与其配体-1（ligands of programmed death-1,PD-L1）相互作用进而介导相关抑制信号通路激活,发挥重要的免疫调节及平衡作用。在慢性病毒感染或肿瘤疾病等特殊生理条件下,PD-1/PD-L1信号通路的过度激活可引发机体出现T细胞增殖、活化抑制,以及影响细胞因子分泌等作用,从而导致T细胞免疫功能出现抑制或耗竭等。现有研究表明,以PD-1/PD-L1为靶点的特异性抗体或小分子阻断制剂能够有效的恢复T细胞免疫功能的抑制或耗竭。特别是其在肿瘤治疗当中的成功临床应用,使其逐渐成为肿瘤治疗领域内的热门靶点之一。犬作为人重要的伴侣动物之一,在人类的生活中扮演着不可或缺的角色,而犬肿瘤已经为威胁其生命的因素之一。现有研究证明犬PD-1/PD-L1通路与犬肿瘤疾病所导致的T细胞免疫功能耗竭密切相关,阻断PD-1/PD-L1通路可能成为犬肿瘤治疗的新策略。因此本研究以犬PD-1/PD-L1相互作用的胞外区为主要研究对象,通过构建真核表达系统,筛选出稳定转染细胞系,并表达纯化具有免疫学原性的犬PD-1和PD-L1胞外区真核表达重组蛋白,为犬PD-1及PD-L1单克隆抗体制备,以及研究二者相互作用等研究奠定基础。本研究首先构建含有Kozak序列和Gluc分泌型信号肽的载体pc DNA3.1/MycHis（+）A-Gluc,通过分子生物学技术,克隆犬PD-1和PD-L1胞外区蛋白的DNA序列,并分别插入到相应真核表达载体中,构建真核重组表达载体pc DNA3.1/MycHis（+）A-Gluc-PD-1和pc DNA3.1/Myc-His（+）A-Gluc-PD-L1。将上述构建的真核重组表达载体分别转染至真核细胞CHO-K1中,Western blot初步验证蛋白表达情况并优化转染条件,筛选瞬时转染阳性细胞株。然后,利用G418对筛选获得的瞬转细胞株进行有限稀释及克隆,分别获得表达犬PD-1和PD-L1胞外区蛋白的稳定细胞株。进一步,将所获得的稳定株传代60次后,分别利用半定量PCR技术、CCK8等技术对筛选细胞株外源基因拷贝数、生长曲线,以及细胞活性进行检测,以进一步确认外源基因在所获得细胞株中的稳定表达。最终,利用所筛选得到的稳定细胞株分别表达目的蛋白并纯化,纯化产物经Western blot方法进行免疫学原性分析。结果显示,分别获得了序列大小为432 bp编码犬PD-1胞外区蛋白的基因和序列大小为660 bp的PD-L1胞外区蛋白的基因。成功构建了含有Kozak序列和Gluc分泌型信号肽的犬PD-1和PD-L1真核重组表达载体pc DNA3.1/MycHis（+）A-Gluc-PD-1、pc DNA3.1/Myc-His（+）A-Gluc-PD-L1。瞬时转染后,Western blot结果显示两种转染细胞株成功表达犬PD-1及PD-L1胞外区蛋白。进一步,利用G418对瞬时转染细胞株进行加压筛选,通过有限稀释成功筛选获得表达犬PD-1、PD-L1胞外区蛋白的稳定转染细胞株CHO-K1/PD-1（细胞编号为CCTCC NO:C202138）和CHO-K1/PD-L1（细胞编号为CCTCC NO:C202139）。传代60次后,所筛选的两株细胞仍含有较高目的基因拷贝数,以及良好的生长活性。说明所获得细胞株具有良好的稳定性和活性。最终,利用亲和层析技术分别对两株是筛选细胞的培养上清进行纯化。其中,犬PD-1胞外区蛋白产率约为7 mg/L,犬PD-L1胞外区蛋白产率约为2.8 mg/L。Western blot结果进一步表明,所获得重组蛋白分别能被对应的商品化抗体所识别,具备良好的免疫原性。本研究成功筛选出稳定表达犬PD-1及PD-L1胞外区的细胞株,并通过真核表达的方式纯化获得了具有良好免疫学原性的犬PD-1、PD-L1胞外区重组蛋白。这为犬PD-1及PD-L1单克隆抗体制备,以及二者相互作用机制等研究奠定基础。
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