论文部分内容阅读
目的前期研究表明ATP作用于P2X7R可能是诱发痛风性关节炎发作的第二信号。本研究通过建立稳定表达P2X7R的野生型或突变体型THP-1源性单核细胞系,并在高尿酸背景下分析P2X7R的野生型和三种不同SNPs基因型的功能改变。方法慢病毒转染HEK-293T细胞,并观察HEK-293T细胞对溴化乙锭的摄取能力从而在P2X7通道上观察Ala 348>Thr,Glu 496>Ala和Arg 307>Gln三种不同突变体对P2X7R的影响。另外,慢病毒转染THP-1细胞,建立稳定表达野生型或突变体型的THP-1细胞系,设置野生型、突变体型或空病毒型三型,每型分三组,分别加入MSU(标记M组)、MSU+ATP(标记MA组),空病毒对照组(标记C组)。PMA分别刺激三组细胞,离心撤去PMA;M组和MA组中加入MSU孵育,之后MA组中加入ATP孵育;分别收集三组细胞上清和细胞。ELISA法检测三组上清中IL-1β蛋白表达水平,q RT-PCR检测三组细胞IL-1β,NLRP3,ASC和Caspase-1 m RNA表达水平。SPSS软件用于分析数据,P<0.05差异有统计学意义。结果(1)经慢病毒转染野生型和三种突变体型的HEK-293T细胞。从趋势上看,细胞内结构域上的突变体型Ala 348>Thr相比于野生型,增强了HEK-293T细胞对ATP诱导下溴化乙锭的摄取,占野生型的145%;另外两个细胞外结构域上的突变体型Glu 496>Ala和Arg 307>Gln相比于野生型,均降低了HEK-293T细胞对ATP诱导下溴化乙锭的摄取,分别占野生型的38%和32%。(2)携带不同突变体的THP-1细胞中IL-1β的表达水平:在高尿酸背景下,MA组中,Ala 348>Thr相比野生型上调上清液中IL-1β水平,差异有统计学意义(P=0.0007);Ala 348>Thr相比空病毒型上调上清液中IL-1β水平,差异有统计学意义(P=0.013);野生型比空病毒型上清液中IL-1β水平高,但差异无统计学意义。Glu 496>Ala相比野生型下调上清液中IL-1β水平,差异有统计学意义(P=0.0189);Glu 496>Ala比空病毒型上清液中IL-1β水平低,但差异无统计学意义。Arg 307>Gln相比野生型下调上清液中IL-1β水平,差异有统计学意义(P=0.0164);Arg 307>Gln比空病毒型上清液中IL-1β水平低,但差异无统计学意义。另外,MA组中,Ala 348>Thr相比野生型上调细胞中IL-1β的m RNA水平,差异有统计学意义(P=0.0334);Ala 348>Thr相比空病毒型上调细胞中IL-1β的m RNA水平,差异有统计学意义(P=0.0307);野生型比空病毒型细胞中IL-1β的m RNA水平高,但差异无统计学意义。Glu 496>Ala相比野生型下调细胞中IL-1β的m RNA水平,差异有统计学意义(P=0.0037);Glu 496>Ala比空病毒型细胞中IL-1β的m RNA水平低,差异无统计学意义(P>0.05)。Arg 307>Gln相比野生型下调细胞中IL-1β的m RNA水平,差异有统计学意义(P<0.001);Arg 307>Gln比空病毒型细胞中IL-1β的m RNA水平低,差异无统计学意义。(3)携带不同突变体的THP-1细胞中NLRP3的m RNA表达水平:在高尿酸背景下,MA组中,Ala 348>Thr细胞中NLRP3的m RNA表达水平相比野生型增加,差异有统计学意义(p=0.0003);Ala 348>Thr突变体型细胞中NLRP3的m RNA表达水平相比空病毒型增加,差异有统计学意义(P=0.0001);野生型细胞中NLRP3的m RNA表达水平比空病毒型高,但差异无统计学意义。Glu 496>Ala细胞中NLRP3的m RNA表达水平相比野生型减少,差异有统计学意义(p=0.0294);Glu 496>Ala细胞中NLRP3的m RNA表达水平比空病毒型低,但差异无统计学意义。Arg 307>Gln细胞中NLRP3的m RNA表达水平相比野生型减少,差异有统计学意义(P=0.0279);Arg 307>Gln细胞中NLRP3的m RNA表达水平相比空病毒型,差异无统计学意义。(4)携带不同突变体的THP-1细胞中ASC的m RNA表达水平:在高尿酸背景下,MA组中,Ala 348>Thr细胞中ASC的m RNA表达水平相比野生型,差异无统计学意义(P>0.05);Ala 348>Thr细胞中ASC的m RNA表达水平相比空病毒型增加,差异有统计学意义(P=0.0138);野生型细胞中ASC的m RNA表达水平相比空病毒型增加,差异有统计学意义(P=0.0022)。Glu 496>Ala细胞中ASC的m RNA表达水平相比野生型低,差异无统计学意义(P>0.05);Glu 496>Ala细胞中ASC的m RNA表达水平比空病毒型高,差异无统计学意义(P>0.05)。Arg 307>Gln细胞中ASC的m RNA表达水平相比野生型低,但差异无统计学意义(P>0.05);Arg 307>Gln细胞中ASC的m RNA表达水平相比空病毒型显著增加,差异有统计学意义(P=0.0283)。(5)携带不同突变体的THP-1细胞中Caspase-1的m RNA表达水平:在高尿酸背景下,MA组中三种突变体型,野生型和空病毒型中Caspase-1的m RNA表达水平比较均未见差异。以上THP-1细胞中C组和M组的突变体型分别与野生型和空病毒型相比均未见差异。结论研究结果显示在高尿酸背景下,突变体型Ala 348>Thr使P2X7R功能明显上调,IL-1β和NLRP3表达水平相应增加,提示该基因变异可能与临床痛风发作有关;而Glu 496>Ala和Arg 307>Gln使P2X7R功能明显下调,同时IL-1β和NLRP3表达水平也相应降低,推测其可能参与抑制痛风的发生。