研究背景丙型肝炎(简称丙肝)是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的一种主要通过血液传播的疾病,HCV已经呈全球性流行。由于丙肝症状不典型,发病隐匿,如果患者不能及早的诊断,则容易错过最佳的治疗时机,给人民群众健康构成严重的威胁[5]。目前预防性疫苗尚未研发成功,控制丙型肝炎的传播、提高丙型肝炎的治疗效果主要依靠及时、准确的实验室检测[6]。目前,主要的实验室检测方法包括HCV抗体检测、HCV抗原检测、HCV核酸检测及HCV基因型检测[7]。HCV抗体检测诞生于20世纪90年代初,是最早用于HCV实验室诊断的方法,具有操作简便、耗时短等优点,广泛应用于血液制品的筛查和临床诊断[8]。通常在临床诊断策略中首先进行HCV抗体筛查试验,结果呈反应性的样本则需要进一步做补充试验进行确证,补充试验有二种方法:重组免疫印记(RIIBA)试验检测和核酸检测;HCV抗原检测是近几年发展起来的一种新型的HCV检测指标,丙肝患者在感染HCV后1～4周左右能够检测出HCV抗原,明显缩短诊断的窗口期,有利于丙肝的早期诊断,抗原检测可用于献血员筛查、抗病毒治疗效果的评价与预后判断、免疫缺陷的患者如HIV感染者、长期透析的肾病患者、器官移植患者或先天免疫功能缺陷的丙型肝炎诊断[15],以及鉴别HCV既往感染或现行感染,它作为一种新的检测方法在一定程度上可以弥补抗体检测方法的不足;HCV RNA在感染1～2周后即可检测出来,HCVRNA的存在是HCV在体内活动最直接的指标,有利于HCV感染的早期诊断,对于评价疾病的治疗和预后具有重要意义,目前通常利用荧光定量法检测HCV的病毒载量;HCV基因分型与病程发展和干扰素治疗应答有密切的关系,不同基因型对抗病毒治疗的应答不同,采取的治疗方案不同[17],对HCVRNA定量结果也有一定的影响,基因型的测定有助于决定抗病毒疗程和药物剂量[18]。研究目的1、构建HCV抗体血清盘、抗原血清盘、核酸血清盘及基因分型血清盘,评估检测抗体、抗原、核酸及基因分型的试剂盒总体性能,评估试剂盒的敏感性、特异性、灵敏度、分析特异性及精密性等性能,选择性能较好的试剂盒进行临床样本的检测;2、检测临床样本的不同标志物,分析RIBA检测结果与ELISA检测结果、与核酸检测结果之间的关系,并分析RIBA各个条带的分布,探讨病毒载量与性别、年龄之间的关系,讨论基因型别的各个地区的分布情况及与性别、年龄、病毒载量之间的关系。研究方法第一部分为方法学的评价:从国家参比实验室库存样本中挑选所需的血清样本,构建HCV抗体血清盘、HCV抗原血清盘、HCV核酸血清盘及HCV基因分型血清盘,构建的各种检测指标血清盘包括基础盘、阳转血清盘(商业)、线性稀释盘、精密度盘、干扰盘等,再选择检测抗体、抗原、核酸及基因分型的试剂盒对各种指标的血清盘进行检测,对检测结果进行统计分析,评估试剂盒的敏感性、特异性、分析特异性、分析灵敏度等总体性能。第二部分为临床样本的诊断:收集1597份感染HCV高危人群的临床样本,对样本的背景信息进行整理,然后选用第一部分评估性能较好的试剂盒进行检测抗体、核酸及基因型别,对抗体首先利用ELISA试剂盒进行初筛试验,初筛试验反应性的样本再进行RIBA检测,并对样本进行核酸定量检测,核酸阳性的样本进行基因分型,先使用HCV基因分型试剂盒检测基因型别,未确定型别的样本再通过直接测序法检测基因型别,然后对检测的各个指标进行统计分析,比较它们之间的临床意义。结果1参与抗体血清盘评估的厂家A、B、C三种抗体检测试剂盒,检测的敏感性均为50/50,特异性则介于48/50～50/50之间;抗体阳转血清盘检测结果为A厂家试剂比B厂家、C厂家抗体试剂的平均延长天数小,提示A厂家试剂相比B、C厂家在早期发现感染者的能力方面更具有优势;抗体干扰血清盘检测结果为三种抗体检测试剂盒的分析特异性均为45/45,对于异常样本的检测未出现假阳性结果;线性稀释血清盘进行检测发现显示三种试剂盒的线性范围不一致,并且不同试剂盒对同一样本的S/CO值不一致,B、C厂家的试剂盒检测高浓度样本的S/CO值比A厂家试剂盒的S/CO值高。对于HCV抗原评价盘评估两种国产抗原试剂盒与核酸结果的一致性,结果显示D厂家、E厂家试剂盒与核酸结果的一致性分别为57/100、63/100,说明部分国产抗原试剂盒与核酸的结果一致性较差,尚不能完全替代核酸用于临床的诊断。对于HCV核酸血清盘检测结果显示F厂家核酸检测试剂盒的特异性为50/50,敏感性为49/50,对一份低浓度的核酸样本存在漏检现象;用商业HCV核酸线性血清盘对F厂家核酸检测试剂盒进行评估线性关系,结果显示具有很好的线性关系,计算出回归公式为y= 1.0189x-0.1693,相关系数R2=0.9916>0.95;核酸灵敏度血清盘结果显示灵敏度的检测下限可设为250IU/ml;核酸干扰血清盘结果显示分析特异性为40/40,分析特异性符合要求;用高浓度和低浓度的病毒载量构建精密度血清盘,计算出的变异系数分别为2.09%和6.46%。利用临床小样本进行评价HCV基因分型试剂盒与直接测序法之间的关系,结果显示通过HCV基因分型试剂盒确定型别样本数为33份(33/45),其中29份样本结果与直接测序法结果一致,有4份基因型1a的样本错判为1b,未检测出的基因型别有3a(1份)、3b(4份)、6a(3份)、6n(4份);再利用商业HCV基因型血清盘进行比对HCV分型试剂盒、直接测序法与预期基因型别结果之间的关系,结果显示HCV基因分型试剂盒检测范围之内的基因型别准确性为9/9,直接测序结果与参考型别结果一致。2.对收集1597份高危人群临床样本,通过酶联免疫吸附法检测抗体反应性的样本数有1278份,核酸定量检测出核酸阳性的样本数为1050份,其中对416份初筛抗体反应性的样本进行重组免疫印迹进行抗体的补充试验,检测出393份抗体阳性、7份抗体不确定、16份抗体阴性,再对RIBA确证抗体阳性或者不确定的400份样本,再进行核酸检测,结果显示400份样本中有315份核酸阳性,有85份核酸阴性的样本,并且对400份RIBA阳性及不确定样本条带和强度分布情况进行分析,发现RIBA五条条带显色强度大于1+的次数,core区出现的最多,出现的频率为 98.5%(394/400),NS3-1 次之,为 79.8%(319/400),而 NS4 区出现的次数最少,频率为28.3(113/400);对319份抗体检测结果为阴性的样本进行核酸检测,并检测出6份核酸阳性的样本;核酸检测的结果按性别、年龄段进行统计分析,发现核酸检测的结果与性别之间没有统计学意义(X2=4.91,P=0.556),而核酸结果与不同年龄段具有统计学意义(X2=2412,P<0.01),并且进行不同年龄段之间两两比较均具有统计学意义,说明不同年龄段病毒核酸的水平不同;对804份核酸阳性的高危人群样本进行基因分型检测,成功确定HCV基因型的样本数为765份,其中通过HCV基因分型试剂盒确定基因型别样本数为622份,对于分型试剂盒未成功确定基因型别的样本再通过扩增CORE区段得到基因型别的样本数为104份,有39份未成功扩增出序列,高危人群常见主要亚型为3b、1b、3a、6n及6a五种型别,分别为32.42%(248/765)、24.97%(191/765)、24.58%(188/765)、7.06%(54/765)、5.62%(43/765),并且 4 份国内稀有基因型别(稀有基因型包括1a、6u),还有15例HCV基因亚型混合感染,HCV混合感染率为1.96%(15/765)(混合感染基因型包括1b/3a、1b/3b、1b/6a、2a/3b、2a/6a、3a/3b、3b/6a),获得的基因型以3型和6型为主,基因1型和2型所占的比例较低,并且没有发现基因4型和5型。结论1.参与评价的三种酶联免疫吸附法抗体检测试剂均具有较高的敏感性、特异性和灵敏度,对检测早期感染的能力差距不是很大,都能够满足临床抗体筛查的所需;选择的两种HCV核心抗原试剂盒与核酸结果的一致性较差,说明部分抗原试剂盒还不能完全替代核酸用于临床诊断,对于核心抗原试剂盒检测出阴性的样本并不能排除HCV感染;该HCV核酸定量试剂盒的敏感性和特异性、精密性、分析特异性等各个指标都较高,线性较好,能够满足临床诊断要求,但是该核酸定量试剂盒在检测某些低载量的样本时可能会存在漏检的现象,因此试剂厂家还需要进一步的提高对低载量检测的灵敏性;HCV基因分型试剂盒对于国内稀有基因型的检测可能会出现错判现象,但对于国内常见基因亚型的检测结果与直接测序法的结果一致性较高,仅有少量样本未检测出结果,需进一步用直接测序法来确定基因型。2.ELISA抗体检测试剂盒的灵敏性、特异性均有所提高,检测结果与RIBA符合率较高,几乎与RIBA结果保持一致,可以考虑对于高危人群检测利用酶联免疫试剂进行筛查试验,检测结果阳性的样本直接进行核酸检测,不需要再使用RIBA作为补充试验,因此建议高危人群临床诊断选择一种性能优良的ELISA试剂和核酸试剂进行联合检测。对于核酸检测试剂盒的选择应该选择一种检测下限较低的HCV核酸检测试剂盒,为患者核酸诊断提供更加准确的结果,尤其进行抗病毒治疗的患者,疗效的预测、检测都取决于灵敏的HCVRNA的检测。RIBA条带显示CORE区片段出现的频率较高,NS4区片段出现的频率最低。因此高变异区的条带与试剂盒包被的对应抗原结合效率较低,还需要继续加强对HCV NS4等蛋白的表达纯化和抗原性研究。对于高危人群抗体检测呈阴性的样本建议再进行核酸阴性集合检测,防止高危人群的漏检,尤其对早期感染的患者进行尽早诊断、尽早治疗,减少丙肝疾病所造成的负担。高危人群HCV感染者的基因型主要为3型、6型及1b,基因型分布具有地域性差异,并且性别和病毒载量与基因型的分布具有相关关系。本研究只是对高危人群丙型肝炎基因型分布特点进行了初步分析,还须要收集更多样本加上流行病学知识进一步的深入研究。为高危人群HCV感染者疾病防治提供更强有力的依据,同时对今后HCV诊断试剂盒和疫苗研制有着重要指导意义。