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野生大豆(Glycine soja L.)是栽培大豆(Glycine max L.)的祖先,原产于东亚,从俄罗斯东部到中国南部都有广泛分布,这使得野生大豆具有丰富的遗传多样性;野生大豆在人类驯化和利用的过程中,丢失了很多野生大豆的有利性状,尤其是与生物胁迫和非生物胁迫抗性相关的基因。而栽培大豆作为一种重要的粮食和油料作物,在生长过程中经常会受到多种逆境胁迫导致减产,因此研究野生大豆中具有抗逆功能的基因对于提高大豆耐胁迫能力具有重要意义。GsPIP1-4是水通道蛋白家族基因,与水分转运密切相关,本研究通过克隆野生大豆GsPIP1-4基因,并采用农杆菌介导法将其转入栽培大豆转基因受体天隆一号中,研究水培条件下PEG模拟干旱和温室盆栽干旱GsPIP1-4基因对大豆生理和生化特性的影响。主要研究结果如下:1.GsPIP1-4基因的克隆与生物信息学分析。以GsPIP1-4基因CDS序列两端添加Xba1位点设计引物,经测序后BLAST比对验证,成功在野生大豆中克隆出该基因完整CDS序列;将GsPIP1-4基因与拟南芥、水稻、茶树等PIP1-4基因通过生物信息学分析同源性多序列比对及系统进化树(图2.7)分析表明大豆GsPIP1-4基因与栽培大豆、水稻、拟南芥GsPIP1-4基因编码蛋白的序列同源一致性较高,反映出GsPIP1-4蛋白的氨基酸序列保守性较高(图2.5),通过对GsPIP1-4的保守域分析,证明GsPIP1-4蛋白属于MIP大家族,并且含有该家族特有的两个NPA(天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸)单元及两亲性分子孔道(图2.6);通过GsPIP1-4与绿色荧光蛋白GFP的融合表达试验(图2.9),发现GsPIP1-4编码蛋白定位在细胞质膜上;qRT-PCR分析它的表达模式发现GsPIP1-4在野生大豆荚、花和根中表达较高,而在叶片和茎中表达较低;分析GsPIP1-4在干旱胁迫下的反应发现,ABA处理时,其在叶片中表达先下降后上升;在PEG处理时,其在叶片中表达呈现先上升后下降的趋势,说明干旱胁迫能够诱导GsPIP1-4基因的表达。以上研究GsPIP1-4基因说明属于水通道蛋白家族,且可能在干旱胁迫信号中起重要作用。2.GsPIP1-4基因抗旱生理功能分析。为明确GsPIP1-4基因的生理功能,我们将从野生大豆中克隆的基因片段构建在含有Bar标记基因的载体pLM-B001上,通过以草丁膦为筛选剂的大豆转化体系获得7株T0代转GsPIP1-4基因的大豆材料,以表达量较高的L5、L12和L15三株系进行干旱处理实验,并以非转化转基因阴性大豆种子(NT)做对照。在正常培养条件下各转基因株系与非转基因植株生长无差异,而在20%PEG8000模拟干旱处理后三个GsPIP1-4转基因株系地上及地下部分干重减少量以及根长的减少量均小于非转基因植株,且L5、L12和L15株系的叶片相对失水率较非转基因低,以减少植物体内水分散失;分析正常与干旱条件下各株系根系形态指标,非转基因植株在根长、根表面积、根体积及分枝数这几个指标上较转基因株系L5、L12和L15降低得更多;在正常水培条件下,转基因株系的净光合速率(A_N)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)等都略高于对照组,干旱后各光合指标下降但三转基因株系仍显著高于非转基因植株;在干旱胁迫条件下GsPIP1-4-oe大豆叶片的气孔相比NT能保持较高的开孔状态,与前面测定的气孔导度Gs和蒸腾速率Tr的变化一致;转基因植株叶片中脯氨酸含量及脯氨酸合成和分解酶活性,SOD、POD、APX、CAT等抗氧化酶活性也高于NT;在大田环境中GsPIP1-4-oe大豆能通过增加分枝及荚数等提高产量。综上,GsPIP1-4在调控水分平衡等方面具有重要功能,抗逆转基因大豆的培育不仅具有科学理论意义,而且也有巨大的应用价值。