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本研究在已经验证成功地将植酸酶基因转入海水小球藻并检测到植酸酶表达的基础上,进行植酸酶表达稳定性分析,对转基因小球藻进行生理生化分析,考察培养条件、培养基组成对转基因小球藻的生长及植酸酶酶活的影响,得出优化组合,为今后大规模高密度培养打下基础,对于深入开发微藻资源及植酸酶的应用具有深远的意义。
通过三种方法对转基因小球藻进行破碎,比较蛋白和植酸酶酶活的测量数值,得出超声波破碎法对细胞壁的破碎更完全,能获得更高的测量值。确定使用超声波破碎法破壁的最佳时间为8min。
从G418抗性平板上挑42个转植酸酶基因小球藻单克隆藻株,培养到一定量,通过植酸酶活性比较,筛选出植酸酶酶活较高的8株藻,经过7次传代,植酸酶活并无衰减趋势,证实植酸酶基因在小球藻中稳定表达。对转基因小球藻产生的植酸酶进行酶性质研究,此酶最适作用pH值为pH3.8和pH6.0,最适作用温度为65℃,耐热能力较好,有利于饲料加工过程酶活的保持。在相同培养条件下,转基因藻与未转基因藻生理指标并无明显差异,说明外源植酸酶基因的转入对小球藻的生长及生理指标无明显影响。
考察接种量、温度、pH、光强对小球藻生长与植酸酶酶活的影响。单因素实验结果:接种量浓度取0.074~0.126mg/ml之间,温度22.5℃,pH值8~10,光强范围:1000~5000lx。做温度、pH、光强三因素三水平的正交实验得出:获得转基因小球藻最大密度的优化组合为:22.5℃,pH值9.5,光强4500±100lx;获得最大植酸酶活的优化组合为:温度25℃,pH值8,光强1000±100lx,并通过验证实验得以证实。
考察碳源、氮源、磷源、维生素对转基因小球藻的生长及植酸酶酶活的影响。单因素实验结果:0.2g/LNaHCO3;0.5g/LNH4NO3;0.02g/LKH2PO4(获得最大比生长速率μmax),0.08g/LKH2PO4(获得最大檀酸酶比活值P.Amax);0.3mg/LVB1(μmax),0.6mg/LVB1(P.Amax);4μg/LVB12(μmax),1μg/LVB12(P.Amax)。对NaHCO3,NH4NO3,KH2PO4,VB1与VB12做五因素四水平的正交实验,结果表明,获得转基因小球藻最大密度的优化组合为:A4B1C1D1E1,即:NaHCO30.4g/L,NH4NO30.25g/L,KH2PO40.02g/L,VB10.15mg/L与VB120.5μg/L。获得转基因小球藻最大植酸酶比活值的优化组合为:A3B2C3D3E2,即:NaHCO30.3g/L,NH4NO30.50g/L,KH2PO40.08g/L,VB10.60mg/L与VB122.0μg/L。A3B2C3D3E2组合所得藻密度分别是基础培养基和f/2培养基的1.11和1.36倍,植酸酶比活值分别是基础培养基和f/2培养基的2.76和2.78倍。