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背景:骨肉瘤是青少年最常见的恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率呈逐年升高趋势,因其症状隐匿且无明显临床症状,加上大部分患者对骨肉瘤缺乏了解及早期诊断的不完善,患者就诊时往往处于中晚期,导致目前国内外骨肉瘤的早期发现、早期诊断和治愈率极低。骨肉瘤的发病机制包括环境因素和遗传因素,其中遗传相关发病机制包括基因突变、单核苷酸多态性和表观遗传学,基因突变指的是依赖于DNA碱基序列改变导致基因表达异常,而不依赖于DNA碱基序列改变的表观遗传学调控方式在骨肉瘤的发病机制中越来越受重视,其中基因启动子甲基化异常是表观遗传学最常见的作用机制。DKK3基因为新近发现的抑癌基因,主要通过抑制Wnt信号传导通路调控细胞增殖与凋亡,同时可通过调节血管内皮生长因子受体2抑制肿瘤血管生成,DKK3基因过表达时可显著抑制β 2微球蛋白介导的血管内皮生长因子受体2磷酸化而增加肿瘤微血管产生。此外,研究发现DKK3基因可抑制Wnt信号传导途径中的Wnt/β-catenin、Wnt/基质金属酶蛋白2和Wnt/JNK等通路抑制细胞增殖并促进细胞凋亡,DKK3基因表达下降可导致其mRNA和蛋白质表达下降,继而调节细胞增殖凋亡能力下降而产生各种恶性肿瘤。越来越多的研究证实,DKK3基因表达异常是多种恶性肿瘤的主要发病机制,检测DKK3基因和表达在恶性肿瘤病情及预后评估中具有重要价值,较传统的蛋白质水平的肿瘤标志物具有更高的灵敏度及特异性。基于于目前的研究发现及DKK3基因作为Wnt/β-catenin信号传导通路调控因子这一事实,推测DKK3基因启动子甲基化在骨肉瘤病情及预后评估中具有一定价值。甲基化寡核苷酸是人工设计的与靶向基因互补的含有20bp左右寡核苷酸,不过其中CG被人为化学合成添加甲基变为甲基化CG,与靶向基因互补结合后形成半甲基化链,在DNA甲基转移酶催化作用下诱导互补链产生甲基化,随后重复上述过程产生甲基化改变,最终导致靶向基因产生甲基化异常而改变基因表达,目前多个研究中均证实甲基化寡核苷酸可成功诱导产生靶向基因沉默。第一部分:骨肉瘤DKK3基因启动子甲基化检测及其临床价值目的:检测骨肉瘤患者DKK3基因启动子甲基化并研究其临床价值。方法:选择2011年9月至2014年1月武汉大学人民医院湖北省人民医院骨科和华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科诊治的骨肉瘤患者(OST组)为研究对象,均经影像学检查、生化检查、活检病理组织学和(或)术后病理组织学确诊。另选择同期治疗的骨折或化脓性关节炎等骨良性疾病患者为对照组(CON组)。OST组骨肉瘤患者和CON组骨良性疾病患者在性别、年龄和体质量指数方面均具有可比性。分别取OST组骨肉瘤患者肿瘤组织和CON组骨良性疾病患者组织提取基因组DNA后采用甲基化特异性PCR检测DKK3基因启动子甲基化状态并比较其差异,分析不同临床病理因素中DKK3基因启动子甲基化的差异并研究DKK3基因启动子甲基化和未甲基化患者预后的差异。统计并比较OST组骨肉瘤患者中DKK3基因启动子甲基化患者和未甲基化患者RO切除率、3年死亡率、无进展生存期和总生存期的差异。分别采用RT-PCR和Western blot法检测OST组骨肉瘤患者和CON组骨良性疾病患者组织DKK3基因mRNA和蛋白质表达并比较其差异。结果:(1)OST组骨肉瘤患者肿瘤组织中DKK3基因启动子发生甲基化54例,甲基化率为72.0%,CON组骨良性疾病患者1例DKK3基因启动子甲基化,甲基化率为2.5%,OST组骨肉瘤患者肿瘤组织DKK3基因启动子甲基化率显著高于CON组骨良性疾病患者(P<0.05);(2)OST组骨肉瘤患者肿瘤组织中DKK3基因启动子甲基化在性别、年龄、病变位置、家族史和病理类型方面差异均无统计学意义(均P>0.05),在卡氏评分、病理性骨折、Enneking分期、肿瘤最大径、治疗方法和远处转移方面差异均存在统计学意义(均P<0.05),卡氏评分<70分、肿瘤最大径≥6cm、有病理性骨折、综合治疗、有远处转移及Ⅱ B+Ⅲ期患者肿瘤组织DKK3基因启动子甲基化率显著高于卡氏评分≥70分、肿瘤最大径<6cm、无病理性骨折、单纯手术治疗、无远处转移及Ⅰ +ⅡA期患者(均P<0.05);(3)OST组骨肉瘤患者中DKK3基因启动子甲基化患者RO切除率、无进展生存期和总生存期均显著低于DKK3基因启动子未甲基化患者,而3年死亡率显著高于未甲基化患者,差异均具有统计学意义(均P<0.05);(4)OST组骨肉瘤患者中DKK3基因mRNA和蛋白质表达均显著低于CON组骨良性疾病患者,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)骨肉瘤患者肿瘤组织DKK3基因启动子甲基化率显著高于骨良性疾病,骨肉瘤患者中DKK3基因启动子处于高甲基化状态;(2)骨肉瘤患者肿瘤组织中DKK3基因启动子甲基化在卡氏评分、病理性骨折、Enneking分期、肿瘤最大径、治疗方法和远处转移方面差异均存在统计学意义,卡氏评分<70分、肿瘤最大径≥6cm、有病理性骨折、综合治疗、有远处转移及ⅡB+Ⅲ期患者肿瘤组织DKK3基因启动子甲基化率显著高于卡氏评分≥70分、肿瘤最大径<6cm、无病理性骨折、单纯手术治疗、无远处转移及Ⅰ+ⅢA期患者;(3)骨肉瘤患者中DKK3基因mRNA和蛋白质表达均显著降低;(4)DKK3基因启动子高甲基化可能是DKK3基因低表达的因素,DKK3基因启动子高甲基化与骨肉瘤发病机制紧密相关,可能在骨肉瘤病情及预后评估中具有重要价值。第二部分:甲基化寡核苷酸诱导灭活DKK3基因对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响目的:研究甲基化寡核苷酸诱导灭活DKK3基因对骨肉瘤细胞甲基化、基因表达、增殖和凋亡的影响。方法:采用甲基化特异性PCR、RT-PCR和Westernblot检测不同骨肉瘤细胞株DKK3基因启动子甲基化状态和基因表达。针对靶向DKK3基因设计合成寡核苷酸序列,分别将寡核苷酸(MON组、UMON组、CON1组、CON2组和CON3组)转染至SA0S-2骨肉瘤细胞,采用重亚硫酸盐测序法检测DKK3基因启动子甲基化改变,采用CCK8检测转染前、后五组细胞增殖并绘制生长曲线,采用流式细胞仪检测检测转染前、后五组细胞周期及凋亡,计算凋亡指数,分别采用RT-和PCR和Western blot检测MON组、UMON组、CON1组、CON2组和CON3组SA0S-2骨肉瘤细胞DKK3基因mRNA和蛋白质表达并比较其差异。结果:(1)SA0S-2骨肉瘤细胞DKK3基因启动子未检测到甲基化改变,MG-63、143B和HOS骨肉瘤细胞DKK3基因启动子可检测到甲基化异常,SAOS-2骨肉瘤细胞DKK3基因表达显著高于MG-63、143B和HOS骨肉瘤细胞;(2)MON组SA0S-2骨肉瘤细胞DKK3基因启动子第1～5CG甲基化率为100.0%,第6～8CG位点甲基化率为0.0%;UMON组、CON1组、CON2组和CON3组细胞DKK3基因启动子第1～8CG甲基化率为0.0%;(3)MON组细胞D1-D7细胞吸光值均显著高于CON1组、CON2组和CON3组细胞吸光值(P<0.05);(4)MON组SAOS-2骨肉瘤细胞G0/G1期比例和凋亡率显著低于UMON组、CON1组、CON2组和CON3组细胞(均P<0.05),而S期、G2/M期和PI均显著高于UMON组、CON1组、CON2组和CON3组细胞(均P<0.05);(5)MON组SAOS-2骨肉瘤细胞DKK3基因mRNA和蛋白质表达均显著低于UMON组、CON1组、CON2组和CON3组SAOS-2骨肉瘤细胞细胞(均P<0.05)。结论:(1)并非所有骨肉瘤发病机制与DKK3基因甲基化有关;(2)设计合成的靶向甲基化寡核苷酸可成功诱导骨肉瘤细胞DKK3基因启动子产生甲基化并导致其mRNA和蛋白质表达显著降低:(3)诱导灭活DKK3基因启动子后骨肉瘤细胞增殖增加,凋亡减少;(4)甲基化寡核苷酸诱导骨肉瘤细胞DKK3基因启动子产生甲基化后可改变骨肉瘤细胞生物学行为,DKK3基因启动子甲基化异常可能为骨肉瘤发病机制之一。