作物杂种优势利用是提高产量的一条有效途径,质核互作雄性不育在杂种优势利用中具有重要作用。尽管诸多学者对大豆质核互作雄性不育开展了广泛研究,但其分子机理仍不清楚。关于DNA曱基化与质核互作雄性不育的关系在水稻等作物上已有报道,但在大豆上尚未有相关报道,因此本研究拟开展大豆不育系NJCMS1A与其保持系NJCMS1B的DNA甲基化比较分析及候选基因的克隆,获得主要结果如下:1、利用MeDIP-seq技术分别检测了大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A与其保持系NJCMS1B的全基因组DNA甲基化。MeDIP-seq测序显示clean reads在染色体上的分布比较均匀,可覆盖大豆基因组中绝大多数的CpGs,主要分布于转座元件、启动子、内含子等基因组元件。DNA甲基化图谱分析显示,NJCMS1A与NJCMS1B的DNA曱基化图谱相似,其中转录起始位点(TSS)和转录终止位点(TTS)附近的甲基化水平最低,当远离上述两个位点时甲基化水平骤然上升,而且基因体的曱基化水平要高于TSS上游2 kb和TTS下游2 kb区域。不同基因组元件中的甲基化峰分布表明,转座元件中的曱基化峰数目最多,而5’UTR、3’UTR和编码序列(CDS)中的甲基化峰数目较少,转座元件中又以长末端重复(LTR)和末端反向重复(TIR)发生曱基化的数目最多。NJCMS1A与NJCMS1B间共鉴定出178个差异曱基化基因,其中156个表现下调、22个表现上调(以NJCMS1B为对照)。GO功能分析表明,114个差异曱基化基因注释到一个或多个GO类别,其中有4个GO term为显著富集;KEGG代谢通路分析表明,18个差异曱基化基因参与并富集于同源重组、嘌呤代谢、蛋白酶体、非同源末端连接、嘧啶代谢等通路。此外,利用重亚硫酸盐测序技术对8个差异曱基化区域进行了验证,发现有6个差异甲基化区域的DNA曱基化模式与MeDIP-seq结果一致,说明MeDIP-seq测序结果是可靠的。2、综合MeDIP-seq结果和前期的转录组数据,筛选出GmGST 12和GmIscU1-like两个候选基因进行了克隆和表达分析。从NJCMS1A和NJCMS1B的花蕾中克隆了GmmGST12和GmIscU1-like基因,其ORF分别为708 bp和516 bp。生物信息学分析表明,GmGST12和GmlscU1-like分别编码谷耽甘肽S-转移酶(GST)和铁硫簇支架蛋白,GmGST 12具有GST_N和SCOP两个保守结构域,GmIscU1-like具有一个IscU_like保守结构域。系统进化树分析发现,GmGST 12和GmIscU1-like分别与辣椒CcGST 12和蒺藜苜蓿MtISU1的同源性最高,氨基酸序列一致性分别为53%和83.72%。组织表达分析表明,GmGST 12在NJCMS1A花蕾中的表达水平显著地高于NJCMS1B,而在根、茎、叶中的表达没有差异,GmIscU1-like在NJCMS1A的根、茎和花蕾中的表达水平均显著地高于NJCMS1B,而在叶中的表达水平却显著地低于NJCMS1B。亚细胞定位结果表明GmGST 12定位于全细胞。构建了植物过表达载体pCAMBIA3301-GFP-GmGST 12 和 pCAMBIA3301-GFP-GmIscUU1-like,并成功转化了根癌农杆菌,为转基因功能验证研究奠定了基础。