第一部分小鼠脊髓损伤后微循环的病理生理改变目的：脊髓损伤是世界范围内无法治愈的疾病,目前,微血管已成为脊髓损伤研究的热点,周细胞因其独特定位于微血管而日益受到关注。脊髓损伤后周细胞的病理反应尚不明确。已有文献报道周细胞与血脑屏障和微血管功能有直接关系。本文拟探讨周细胞对脊髓损伤后微血管病理生理变化的影响。方法：C57BL/6小鼠随机分为：假手术组(Sham组)、损伤后2、7和14d组(S2、S7和S14),每组20只。损伤组采用改良Allen’s法制作中度脊髓损伤模型。腹腔注入伊文思蓝(EB),检测血脊髓屏障的通透性；给小鼠颈静脉注入LEA,检测灌注微血管面积；用免疫荧光和免疫组化检测微血管面积和数目；用免疫荧光检测周细胞覆盖率。用缺氧条件(95%N2,5%CO2)模拟脊髓损伤的病理条件,用ELISA方法检测周细胞分泌的VEGF、TGF-β和Ang-1的变化,用免疫印迹方法来检测VEGFR2、PDGFRβ、HIF-1α、NG2和α-SMA蛋白表达,分别用明胶酶谱和免疫印迹来检测MMP2的分泌和表达情况,用基质胶系统来考察周细胞对内皮成管的影响。结果：1)EB的定性和定量实验结果表明,脊髓损伤后BSCB通透性显著升高。对外渗的EB染料进行定量分析,假手术组、损伤后2d、损伤后7d和损伤后14d(S2、S7和S14)的EB渗出量分别为0.06±0.01、0.81±0.16、0.47±0.12和0.15±0.07(μg/mg)。与假手术组相比,S2渗出的染料量显著增加(P<0.01),S7、S14通透性与S2相比均呈显著下降趋势,但依然高于假手术组。2)脊髓损伤后,灌注血管受到严重破坏,尤其是高度血管化的灰质。对灌注微血管(直径<100μm)面积进行统计分析,假手术组、S2、S7和S14的灌注血管面积百分比分别是9.46%±0.74%、4.10%±0.44%、4.72%±0.46%和6.07%±0.56%。S2与S7比较,灌注血管面积差异无显著性。与S2相比,S14灌注血管面积显著增高(P<0.05)。3)CD31-免疫阳性内皮细胞的结果显示：S2、S7和S14微血管(直径<100μm)分布分别达到假手术组的40.24%、48.49%和74.09%。与S2相比,S7和S14的血管面积显著增高(P<0.05、P<0.01);免疫组化的结果与免疫荧光的结果一致,与假手术组相比,S2的微血管密度(直径<100μm)显著降低(P<0.001)；与S2相比,S7和S14组的血管密度都有不同程度的增加。4)脊髓损伤后血管新生因子VEGF/VEGFR2和Ang-1蛋白表达的检测结果表明：与假手术组相比,S2组VEGF和VEGFR2表达显著增加(P<0.01、P<0.01),S7和S14组VEGF和VEGFR2的表达持续增加；与假手术组相比,S2组Ang-1的表达显著降低(P<0.01),S7和S14组Ang-1的表达持续下降。5)与假手术组相比,S2组周细胞覆盖率显著降低(P<0.01),随着PDGFR-β或CD13-阳性细胞的增加,观察到周细胞覆盖率持续降低(S7)。S14组PDGFRβ或CD13阳性细胞大量增殖,与血管的位置无法辨识,因此无法定量此时周细胞的覆盖率。6)成功分离了小鼠脊髓微血管内皮细胞和周细胞,并进行了鉴定。与对照组相比,缺氧8h诱导周细胞分泌的VEGF和TFG-β显著增加(P<0.05、P<0.01),分别增加了22.78%和61.08%,而Ang-1的分泌量显著下降(P<0.05),下降了14.88%,VEGFR2, PDGFRβ, HIF-1α及NG2和α-SMA表达显著增加,然而,周细胞并没有分化成内皮细胞和星形胶质细胞。缺氧条件下,周细胞与内皮细胞的共培养会增加内皮的成管。结论：周细胞通过分泌促血管新生因子和血管新生蛋白的表达介导脊髓损伤后的血管新生,周细胞分泌Ang1的降低可能是血管灌注降低的重要原因。第二部分褪黑素对小鼠脊髓损伤后微循环的保护作用及保护机制的研究目的：褪黑素能有效的治疗脊髓损伤,有报道在缺氧模型中,褪黑素能降低微血管损伤。脊髓损伤后褪黑素对微血管的调控作用尚不明确。本研究拟探讨褪黑素在治疗脊髓损伤时对微血管的作用,并进一步从周细胞角度阐明可能的保护机制。方法：健康雄性的C57BL/6小鼠(18～2g)81只,随机分成3组：假手术组(Sham)、溶剂对照组(Veh)和褪黑素给药组(Mel)。采用改良Allen法造成脊髓损伤的模型,冲量为5.0×10.0gmm,打击T10脊髓致中度损伤。BSCB通透性,灌注血管,周细胞覆盖率和免疫印迹的检测按照第一部分提到的方法即可。在损伤后的第2、5、7、10和14天分别对Veh和Mel组进行盲法的BMS评分和BMS亚评分；在损伤后7天,取出9-11胸椎(约1cm)的脊髓,称量湿重,干燥至恒重,称取干质量,按Elliot公式计算脊髓水含量：脊髓水含量=(湿质量—干质量)/湿质量×100%。在氧糖剥夺/再灌注(OGP/R)条件下,原代的周细胞分泌血管生成素1(Ang1)的量用ELISA进行检测,表达ICAM-1用免疫荧光进行检测。结果：本研究中,褪黑素给药7d后,拯救了震中受损的血管和运动神经元;显著提高了运动功能的恢复。褪黑素给药组显著降低了BSCB的通透性,减少了occludin的降解；抑制了水肿的形成和AQP4蛋白的上调。此外,本研究的数据首次显示,脊髓损伤后,周细胞的覆盖率显著下降,褪黑素给药能部分的逆转覆盖率下降。褪黑素给药能提高损伤后Ang-1的表达,抑制ICAM-1的表达并上调Bcl-2/Bax比值。同时,OGP/R条件下,褪黑素能增加周细胞Ang1的分泌,降低ICAM-1的表达。结论：在治疗脊髓损伤时,褪黑素能够改善小鼠脊髓微循环(微血管和BSCB)来发挥保护作用,对微血管的保护作用可能是部分通过增加周细胞覆盖率来实现的,周细胞分泌Ang1能抑制炎症因子ICAM-1的表达,抑制凋亡来保护脊髓微血管。