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猪嵴病毒（Porcine kobuvirus）属于微RNA病毒科嵴病毒属，2008年匈牙利首次报道猪嵴病毒感染。自2010年10月以来，我国持续暴发猪流行性腹泻，有研究显示，猪嵴病毒感染可能和腹泻有关，也有研究表明在健康猪群中猪嵴病毒感染现象普遍存在。因此该病毒致病作用还有待进一步研究。本研究旨在对河南地区猪嵴病毒感染情况进行调查，并对该病毒基因组的分子进化特征和VP1基因生物学功能进行初步研究，为今后猪群中猪嵴病毒进一步的深入研究和筛选抗猪嵴病毒单克隆抗体奠定基础。1.河南地区猪嵴病毒分子检测和VP1基因遗传进化分析收集2010-2012年河南地区84个猪场150份猪腹泻样品和23份无症状猪的粪便样品，对猪嵴病毒的感染情况进行监测，并对8个猪嵴病毒阳性样品的VP1基因进行了测序与序列分析。结果显示检测样品猪嵴病毒总阳性率为82.1%(142/173)，猪场猪嵴病毒总阳性率为82.1%（69/84），表明河南地区各种猪群普遍存在感染猪嵴病毒的现象。其中发病猪群的总阳性率为80.0%(120/150)，临床健康猪群的猪嵴病毒感染率为95.7%(22/23)，两者没有明显差异（P﹥0.05）。提示猪嵴病毒感染与猪腹泻疾病之间可能没有必然联系。扩增出的8个VP1基因（GenBank登录号：KC176717-KC176724）与中国其它地区的猪嵴病毒VP1基因的核苷酸同源性为80.7%~99.9%，推导的氨基酸序列同源性为83.9%~99.6%。遗传进化分析显示所有已知的猪嵴病毒毒株可构成4个分支，河南的8个猪嵴病毒毒株分别位于其中的3个分支上。2.猪嵴病毒XX株全基因序列分析参照文献已报道的序列合成10对引物，以猪嵴病毒阳性病料提取的基因组为模板，用RT-PCR方法对猪嵴病毒全基因组进行扩增，并对全基因组序列进行遗传进化分析和重组事件预测。获得XX株全基因组结构（GenBank登录号为KC204684）与两个参考株S-1-HUN和Y-1-CHI一致，预测切割位点也相同；遗传进化分析表明XX株和其它猪嵴病毒亲缘关系密切，同源性在87.9%~89.1%；基因组各区段和参考株同源性比较结果显示，在核苷酸水平上同源性最高的区域是3’-UTR（98.2%、95.2%），同源性最低的区域是VP0(81.3%、82.4%)；氨基酸同源性最高的部分分别为3B(100%)区和2C（99.1%)，最低部分是VP1（88.2%和87.4%）；重组分析显示在VP0区可能有重组事件发生，重组区域为1466-2155nt。本研究进一步验证了猪嵴病毒基因组的多样性，并提示同源重组可能和位点突变共同推动其进化过程。3.猪嵴病毒VP1基因的原核表达及免疫原性分析设计1对特异性引物，采用RT-PCR法，以猪嵴病毒XX株基因组RNA为模板，扩增出VP1含主要抗原位点基因序列，用限制性核酸内切酶BamH I、Xho I双酶切后，定向克隆到pET32a(+)中，构建重组表达质粒pET32a-VP1，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达。并对诱导条件进行优化。经1.0mmol/L IPTG诱导5h后，进行SDS-PAGE分析表明，重组菌株表达出了约40.6kDa的融合蛋白条带，与预期一致。Western blotting分析表明，该融合蛋白具有特异的生物学活性，为以后建立快速简便特异的免疫学检测方法及制备单克隆抗体提供了较好的抗原。4.建立了猪嵴病毒特异性抗体间接ELISA方法将构建的猪嵴病毒VP1基因原核表达的重组可溶性蛋白和包涵体蛋白经His标签蛋白纯化试剂盒分别进行纯化，并对纯化后的包涵体蛋白进行复性；同时将猪嵴病毒阳性病料经灭菌处理后，制成猪嵴病毒灭活组织疫苗，蛋白抗原和灭活疫苗同时免疫昆明鼠制备抗VP1蛋白和抗猪嵴病毒多克隆抗体。用重组可溶性VP1蛋白作为包被抗原初步建立了检测抗猪嵴病毒抗体的间接ELISA方法，为猪嵴病毒血清学检测及筛选抗猪嵴病毒单克隆抗体奠定了基础。