研究背景:　　肺癌目前已成为人类因癌症死亡的主要原因之一。化疗在肺癌的治疗中发挥着重要作用。化疗药物的多药耐药是导致化疗失败的主要原因,抗肿瘤药物的药理目的是使活性药物到达肿瘤细胞的靶位点,发挥细胞毒作用,导致细胞死亡。阻断这一过程的任一位点,均可使药物失去作用而产生耐药。P糖蛋白(P-gp)是一种ATP依赖性的跨膜外流泵,通过将细胞内化疗药物排出细胞,使肿瘤细胞内化疗药物的蓄积浓度降低而导致耐药。几乎所有人类肿瘤细胞均有不同程度的P-gp表达,对化疗不敏感或疗效差的肿瘤细胞往往有较高的P-gp表达水平。干扰素/维甲酸诱导凋亡相关基因-19(gene associated with retinoid-IFN-induced mortality-19,GRIM-19),是一种应用反义基因敲除的方法分离发现的调节细胞凋亡因子。GRIM-19在多数肿瘤细胞中的表达受抑制,实验证明在肾细胞肿瘤细胞系中,GRIM-19表达明显下调,其下调可以通过增强依赖STAT3(signal transducers and activators of transcription3)基因的表达而促进肿瘤生长,因此认为GRIM-19具有肿瘤抑制因子作用。STAT3在多种恶性肿瘤中呈过度激活及表达状态,乳腺癌及宫颈癌细胞的相关研究表明STAT3可以调节P-gp的表达,增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。血管内皮生长因子(VEGF)是肿瘤血管生成关键的调节因子,能促进新生血管生成。耐药肺腺癌细胞中GRIM-19的表达情况及其与STAT3、VEGF、P-gp的相互关系国内外尚未有报道。　　目的:　　检测GRIM-19在非小细胞肺癌耐药细胞株A549/DDP中的表达情况,将GRIM-19转染到A549/DDP中,观察转染GRIM-19后肺腺癌耐药细胞株A549/DDP对化疗药物敏感性的改变,同时研究GRIM-19与STAT3、P-gp、VEGF的相互关系,探讨GRIM-19对肺腺癌耐药细胞株A549/DDP化疗敏感性及相关基因STAT3、VEGF、P-gp表达的影响。　　方法:　　1、四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测A549与A549/DDP对多种化疗药物敏感性差异　　将A549和A549/DDP细胞分别种植于4个96孔培养板,待细胞贴壁后分别加入不同浓度顺铂(DDP)、丝裂霉素(MMC)、足叶乙苷(VP-16)、长春新碱(VCR),于48h后向培养板内加入MTT,半小时后加入DMSO,检测其吸光度,分别根据吸光度计算IC50值,计算耐药倍数(resistance index,RI)=耐药株IC50值/敏感株IC50值。　　2、实时荧光定量聚合酶链式反应(Q-PCR)方法检测GRIM-19 mRNA、STAT3 mRNA、VEGF mRNA、P-gp mRNA在A549、A549/DDP中的表达　　分别抽取100mm培养皿A549和A549/DDP细胞的总RNA,然后采用Q-PCR法分别检测GRIM-19 mRNA、Stat3 mRNA、P-gp mRNA、VEGF mRNA表达的变化。　　3、蛋白免疫印迹(Western-blot)法检测A549、A549/DDP中GRIM–19蛋白的表达　　分别抽取100mm培养皿A549和A549/DDP细胞的总蛋白,然后采用Western Blot法分别检测GRIM-19蛋白表达的变化。　　4、pIRES-Puro2-GRIM-19-Myc表达质粒进行测序　　表达质粒pIRES-Puro2-GRIM-19-Myc测序观察其是否有基因突变。　　5、将PIRES-GRIM-19-MYC和PIRES-MYC质粒采用脂质体法分别转染顺铂耐药株A549/DDP。　　分别用 Lipofectamine2000将 pIRES-Puro2-GRIM-19-Myc和pIRES-Puro2-Myc转染A549/DDP,用G418(浓度0.60μg/mL)持续筛选4周建立稳转细胞株:A549/DDP-GRIM-19(AD/G)和A549/DDP-CON(AD/C)。　　6、MTT法检测A549/DDP-GRIM-19与A549/DDP-CON对多种化疗药物敏感性差异　　将A549/DDP-GRIM-19与A549/DDP-CON细胞分别种植于96孔培养板,待细胞贴壁后分别加入不同浓度DDP、MMC、VP-16、VCR,于48h后向培养板内加入MTT,半小时后加入DMSO,检测其吸光度,分别根据吸光度计算IC50值,计算逆转倍数(reversal factor, RF)=对照组IC50/实验组IC50。　　7、Q-PCR方法检测GRIM-19 mRNA、STAT3 mRNA、VEGF mRNA、P-gp mRNA在A549/DDP-GRIM19及A549/DDP-CON中的表达　　分别抽取100mm培养皿A549/DDP-GRIM19及A549/DDP-CON细胞的总RNA,然后采用 Q-PCR法分别检测GRIM-19 mRNA、Stat3 mRNA、P-gp mRNA、VEGF mRNA表达的变化。　　8、Western-blot法检测A549/DDP-GRIM-19及A549/DDP-CON中GRIM–19蛋白的表达　　分别抽取100mm培养皿A549/DDP-GRIM-19及A549/DDP-CON细胞的总蛋白,然后采用Western Blot法分别检测GRIM-19蛋白表达的变化。　　9、统计方法　　实验数据采用SPSS17.0软件进行统计分析,计量数据用x±SE表示,两组间均数比较采用t检验,多组间均数比较用单因素方差分析,并经LSD检验;蛋白质印迹法检测各条带灰度值通过专业图像分析软件Image-Pro Plus进行分析;以P值<0.05为差异有统计学意义。　　结果:　　1、A549与A549/DDP对多种化疗药物敏感性差异　　MTT结果显示顺铂耐药株 A549/DDP较 A549对 DDP的耐药倍数为16.86±1.32倍,对MMC、VP-16、VCR耐药倍数分别为7.22±0.73、10.17±0.53、9.17±0.72(p<0.05)。　　2、GRIM-19 mRNA、STAT3 mRNA、VEGF mRNA、P-gp mRNA在A549和A549/DDP中的表达　　Q-PCR结果表明:与敏感株A549相比,耐药株A549/DDP的GRIM-19 mRNA表达低于对应的A549,STAT3、VEGF、P-gp mRNA在A549/DDP中的表达均高于A549(p<0.05)。　　3、A549与A549/DDP中GRIM–19蛋白的表达　　Western Blot法表明:与敏感株A549相比,耐药株A549/DDP的GRIM-19蛋白表达低于对应的A549(p<0.05)。　　4、成功建立稳转细胞株:A549/DDP-GRIM-19(AD/G)和A549/DDP-CON(AD/C)并实现体外持续传代培养　　5、A549/DDP转染GRIM-19后对多种化疗药物敏感性的逆转作用　　MTT结果显示A549/DDP转染GRIM-19后较转染空质粒组耐药性降低,对DDP耐药逆转倍数为3.70±0.91倍,对 MMC、VP-16、VCR耐药逆转倍数分别为1.74±0.70、1.31±0.34、1.62±0.28(p<0.05)。　　6、GRIM-19 mRNA、STAT3 mRNA、VEGF mRNA、P-gp mRNA在 A549/DDP-GRIM-19及A549/DDP-CON中的表达　　Q-PCR结果提示稳定转染GRIM-19后,A549/DDP/GRIM-19的GRIM-19mRNA表达明显高于A549/DDP-CON,而STAT3 mRNA、VEGF mRNA、P-gp mRNA表达与之相反(p<0.05)。　　7、A549/DDP-GRIM19及A549/DDP-CON中GRIM-19蛋白的表达　　Western Blot结果表明:与A549/DDP-CON相比,稳转株A549/DDP-GRIM-19的GRIM-19蛋白表达高于对应的稳转空质粒组(p<0.05)。　　结论:　　1.肺腺癌耐药细胞株A549/DDP的GRIM-19 mRNA及蛋白表达水平均低于其相对应的敏感株A549中的表达,并且基因表达水平的降低伴随有蛋白表达的相应下降;　　2.肺腺癌耐药细胞株A549/DDP的STAT3 mRNA及P-gp mRNA、VEGF mRNA表达水平均高于敏感株A549中的表达。并且在肺腺癌耐药细胞中也存在STAT3高表达与GRIM-19低表达的共存。　　3.通过建立肺腺癌耐药稳转细胞株A549/DDP-GRIM-19和A549/DDP-CON,在体外验证上调GRIM19表达可以下调STAT3、P-gp、VEGF的表达。　　4.上调GRIM-19表达可以逆转肺腺癌耐药细胞对化疗药物的多药耐药。　　5.GRIM-19与P-gp、VEGF的相互关系可能是通过STAT3通路的调节来实现。