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目的:研究TRIM28在结直肠癌转移过程中的作用及分子机制。方法:1、细胞培养:正常结肠粘膜上皮细胞NCM460、结直肠癌细胞和HEK293T细胞用含有10%标准胎牛血清的DMEM培养基培养。所有细胞培养环境:37℃,5%CO2。2、质粒构建:从HEK293T的c DNA中PCR扩增目的基因的全长c DNA,利用重组的方法将其插入克隆载体。将靶向目的基因的sh RNA序列插入PLKO.1载体,构建敲减质粒。所有质粒均经过DNA测序来保证质粒序列正确。3、转染和si RNA干扰:利用转染试剂Lipofectamine 2000按照生产商说明书进行质粒转染和si RNA干扰。4、慢病毒转染和稳转细胞系的构建:利用HEK293T细胞进行慢病毒的包装,收集48小时或72小时含有慢病毒的上清培养基。利用polybrene(8μg/ml)将慢病毒转染Lo Vo,HCT116,SW48细胞,24小时后换液,用嘌呤霉素(1μg/ml)压力筛选一周后检测慢病毒转染效果。5、蛋白印记实验:用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白质,利用BCA试剂盒检测蛋白质浓度。将蛋白样在98℃中煮10分钟后等量蛋白上样,SDS-PAGE进行蛋白质分离,转印到NC膜上,5%的脱脂牛奶室温下封闭一个小时,一抗4℃孵育过夜,二抗室温孵育一个小时后化学发光显色。6、免疫共沉淀实验:细胞用含有蛋白酶抑制剂的IP裂解液裂解,将细胞裂解液孵育相应抗体4℃过夜,然后4℃孵育protein A/G plusagarose beads两小时,用IP裂解液洗三遍,98℃煮5分钟,利用蛋白印记实验进行检测。7、反转录PCR(RT-PCR)和实时定量PCR(q PCR):利用Trizol抽提细胞总RNA,通过M-MLV逆转录酶将RNA逆转录成c DNA。利用RT-PCR试剂和SYBR Green PCR试剂按照生产商说明书扩增目的基因。8、细胞迁移和侵袭实验:将1×105个细胞用无血清DMEM培养基重悬,种植在Transwell小室的上方,小室下方加入含有10%血清的DMEM培养基。细胞培养箱中培养12~48小时后取出,经4%多聚甲醛固定后用0.1%的结晶紫染色,将小室上层的细胞拭去,在显微镜下观察小室下层细胞并计数;细胞侵袭实验:在Transwell小室上层包被基质胶,然后再种植细胞,后续实验和迁移实验一致。9、裸鼠尾静脉转移模型:将2×106个SW48稳定敲减细胞经尾静脉注射入裸鼠体内,5周后处死裸鼠,取肺组织经4%多聚甲醛固定后做苏木精伊红染色,在显微镜下拍照计数癌转移灶。10、TOP flash/FOP flash荧光素酶报告实验:将TRIM28稳定敲低的Lo Vo和HCT116细胞接种到24孔板中,转染TOP-flash或FOP-flash报告质粒48小时后收细胞样。通过双荧光素酶报告分析系统测量相对荧光素酶活性。TOP/FOP比率反映了WNT/β-catenin通路活性。11、免疫组化:采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法,即将收集的15例结直肠癌肿瘤组织和癌旁组织标本经4%多聚甲醛固定后进行石蜡包埋,经复水和微波抗原修复后将石蜡切片标记一抗过夜,然后用结合辣根过氧化物酶的二抗孵育30分钟。用DAB进行染色并用苏木精复染。12、数据分析:使用SPSS 22.0或者Graphpad Prism 5.0统计软件分析实验数据。研究结果:1、体内外实验证明TRIM28敲低促进结直肠癌转移。TCGA数据库和GSE39582数据库分析发现结直肠癌组织中TRIM28的表达水平同结直肠癌患者的总生存期和无复发生存期相关:TRIM28高表达的结直肠癌患者预后更好(P<0.05);Transwell迁移和侵袭实验发现TRIM28敲低后结直肠癌细胞Lo Vo、HCT116、SW48迁移和侵袭能力增加,裸鼠体内实验证实TRIM28表达降低促进结直肠癌肺转移。2、TRIM28同CARM1相互结合并通过CARM1抑制结直肠癌转移。Co-IP实验显示TRIM28蛋白羧基末端PHD/BRO结构域和CARM1蛋白氨基末端EVH1结构域相互结合。Transwell迁移实验发现CARM1敲低后促进结直肠癌细胞迁移。在TRIM28稳定过表达细胞中敲减CARM1,发现CARM1敲低能够抵消TRIM28过表达所致的抑制细胞迁移效应。3、TRIM28通过与CARM1蛋白相互结合抑制CARM1蛋白泛素化降解以及结直肠癌转移。WB和RT-PCR结果显示TRIM28敲减的Lo Vo和HCT116细胞中CARM1蛋白表达水平降低,而RNA水平无变化;在CARM1敲低的Lo Vo和HCT116细胞中TRIM28蛋白表达水平无变化。蛋白质半衰期实验发现TRIM28敲低后CARM1蛋白的半衰期缩短,其蛋白稳定性降低。在TRIM28敲低的Lo Vo和HCT116细胞中加入蛋白酶体抑制剂MG132后TRIM28敲低的细胞其CARM1蛋白表达水平与未敲减的对照细胞无明显差异,均高于未加MG132组。利用TRIM28稳定敲减的细胞进行泛素化实验,发现TRIM28敲低后CARM1蛋白的泛素化水平升高。相较于野生型TRIM28,过表达TRIM28 E3泛素连接酶失活的突变体(TRIM28 C65/68A)以及含有PHD/BRO结构域的TRIM28截短体也可以抑制CARM1蛋白的泛素化水平,并抑制结直肠癌转移,而不含PHD/BRO结构域的TRIM28截短体则不能。4、TRIM28通过CARM1抑制WNT/β-catenin通路从而影响结直肠癌转移。数据库分析发现结直肠癌中TRIM28同β-catenin表达水平呈负相关。WB结果显示在Lo Vo和HCT116细胞中,TRIM28敲低细胞中β-catenin蛋白表达水平升高;而过表达TRIM28后,细胞中β-catenin蛋白表达水平下调。q RT-PCR结果显示在TRIM28敲低的Lo Vo和HCT116细胞中WNT/β-catenin通路下游靶基因AXIN2、C-Myc、TCF4转录水平增高,在CARM1敲减的细胞中有着一致的结果。TRIM28敲低的Lo Vo和HCT116细胞细胞核中β-catenin表达升高。利用TOP/FOP荧光素酶报告系统,我们发现TRIM28敲低后WNT/β-catenin通路转录活性增加,加入WNT通路阻断剂XAV939后能抑制TRIM28敲减引起的WNT/β-catenin通路激活,并且XAV939能抑制TRIM28敲减所致的促肿瘤迁移的生物学表型。这提示TRIM28在结直肠癌中通过调节WNT/β-catenin通路来发挥生物学效应。在稳定过表达TRIM28的Lo Vo和HCT116细胞中,瞬时敲减CARM1后进行XAV939处理,可以抑制CARM1敲减所致的β-catenin表达水平升高以及结直肠癌细胞迁移。5、TRIM28/CARM1在结直肠癌中的表达及临床意义。收集15对结直肠癌癌组织和癌旁临近组织,通过WB和免疫组化染色发现TRIM28和CARM1均在结直肠癌组织中低表达。通过对结直肠癌数据库GSE39582进行分析,发现TRIM28的表达同结直肠癌患者的临床病理分期相关(P<0.05);CARM1的表达同结直肠癌患者的T分期和M分期相关(P<0.05)。通过COX回归模型分析GSE39582数据库,发现TRIM28表达水平可以作为预测结直肠癌患者预后的独立指标(P=0.026),TRIM28低表达是结直肠癌患者预后的独立危险因素(RR=1.464,95%CI:1.047-2.045);单因素分析发现CARM1低表达的结直肠癌患者预后较差(P<0.05),但多因素分析却表明CARM1表达水平不能作为结直肠癌患者预后的独立指标(P=0.079)。将TRIM28和CARM1两个指标结合起来进行生存期分析发现可以更好预测结直肠癌患者的预后:TRIM28和CARM1高表达的结直肠癌患者预后最好(P<0.05)。结论:TRIM28抑制结直肠癌转移。TRIM28和CARM1蛋白相互结合,并保护CARM1蛋白使其不被泛素-蛋白酶体途径降解。TRIM28通过调节CARM1抑制WNT/β-catenin通路,从而抑制结直肠癌转移。TRIM28和CARM1在结直肠癌组织中低表达,两者低表达的结直肠癌患者预后不良。