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目的：探讨骨桥蛋白(OPN)及其主要受体——整合素αV亚基(ITGAV)表达与喉和下咽鳞状细胞癌血管生成和侵袭转移等生物学行为的相关性,以及ITGAV基因表达抑制对喉癌细胞增殖和凋亡的影响,为临床预测喉和下咽鳞状细胞癌的转移和预后提供新型的分子标记物,并为喉癌的基因治疗寻找有效的治疗靶点。
方法：①设计制作喉和下咽鳞状细胞癌组织芯片,应用免疫组织化学方法在组织芯片上检测OPN和ITGAV的蛋白表达,并应用专业级病理图像处理软件对免疫组化结果进行定量分析,探讨OPN和ITGAV表达与喉和下咽鳞状细胞癌侵袭转移的相关性。②应用CD105免疫组化染色标记肿瘤微血管密度(IMVD),探讨OPN和ITGAV表达与肿瘤血管发生的相关性。③设计合成靶向ITGAV的反义寡核苷酸序列(ASONs),应用脂质体为载体转染ASONs进入体外培养的喉癌细胞(Hep-2),转染后应用RT-PCR技术检测喉癌细胞ITGAV基因表达,免疫荧光技术检测ITGAV蛋白表达,MTT法检测细胞增殖力,Boyden小室体外侵袭试验检测细胞侵袭能力,流式细胞术检测细胞凋亡,探讨ASONs诱导的ITGAV基因表达抑制对喉癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。
结果：①包含75例喉和下咽鳞状细胞癌原发灶、29例癌旁正常组织和20例淋巴结转移癌的组织芯片制作成功。应用该芯片进行免疫组化定量研究,结果显示：原发癌和转移癌OPN和ITGAV的表达量均显著高于正常组织(P<0.001),原发癌按照不同因素分组,OPN和ITGAV的表达量均与肿瘤的分化程度和淋巴结转移密切相关,高分化组OPN和ITGAV的表达量均明显低于中分化组(P<0.001)和低分化组(P<0.001)：有淋巴结转移组(N+)OPN和ITGAV的表达量均显著高于无淋巴结转移组(N0,P<0.001);OPN和ITGAV表达与病人的年龄、性别、肿瘤部位和浸润范围(T分期)均无明显关系(P>0.05)。②OPN和ITGAV的表达量在原发癌和转移癌中均呈显著的正相关(P<0.05),而在正常组织中则无明显的相关性(P>0.05);二者的协同表达与喉和下咽鳞状细胞癌的转移和预后关系密切,OPN和ITGAV共表达组发生淋巴结转移的比率明显高于二者单一表达组和阴性表达组(P<0.01),临床3～4期所占比例也显示同样趋势(P<0.05)。③ITGAV的表达量与CD105标记的IMVD值有明显的相关性,ITGAV阳性组IMVD值显著高于弱阳性组和阴性组；未能发现OPN的表达与肿瘤新生血管数量的相关性。④靶向ITGAV的ASONs对喉癌细胞的生长有明显的抑制作用,ASONs转染后喉癌细胞ITGAV的基因和蛋白表达均明显下调,细胞增殖力和侵袭力明显减弱,并出现显著的细胞凋亡,且有时间和浓度依从性。
结论：①组织芯片作为一种新型的组织病理学研究载体,具有方便、快捷、结果可靠、可比性强的优点,是对大量组织标本进行高通量分析的有力工具。②OPN和ITGAV在喉和下咽鳞状细胞癌组织中均为高表达,并与喉和下咽鳞癌的分化程度和淋巴结转移关系密切,二者在原发癌和转移癌中的表达量均有明显的相关性,所诱发的生物学效应也十分相似,提示二者在肿瘤发生和演进的过程中存在互为调控的机制,OPN和ITGAV的共同表达可能成为临床预测喉癌和下咽癌淋巴转移趋势的指标之一,提示肿瘤预后不良。③ITGAV的表达与喉和下咽鳞状细胞癌新生血管的形成密切相关,其过量表达可能通过诱发新生血管形成而导致肿瘤发生侵袭和转移,未能发现OPN表达与喉和下咽鳞癌血管生成的相关性。④靶向ITGAV的反义寡核苷酸序列(ASONs)能够在转录和翻译水平明显抑制ITGAV的表达,ASONs诱导的ITGAV表达抑制对喉癌细胞的增殖和侵袭能力有明显的抑制作用,并可诱导喉癌细胞发生明显的凋亡,以ITGAV作为抑制靶点的肿瘤靶向治疗可能成为喉和下咽鳞状细胞癌基因治疗的新方向。