本课题分二部分，分别从体外培养和体内移植两个方面研究人胚神经干细胞的特性。各部分研究摘要如下： 第一部分：不同胚龄人神经干细胞的分离培养 目的：从7周和13周人胚脑中分离培养并鉴定神经干细胞，探索不同胚龄神经干细胞分离、培养和长期扩增的适宜条件。 方法：在多种培养条件下，采用含有EGF，bFGF和LIF的无血清培养基分别从7周龄和13周龄的胚脑中分离培养出神经干细胞，通过贴壁单细胞克隆形成法获得来自单个细胞的克隆球，机械切割法长期传代，应用免疫荧光染色分别对神经干细胞的标志物Nestin和分化后成熟的三种神经细胞标志物NSE、GFAP和CNP进行检测。 结果：联合应用EGF，bFGF和LIF成功地从两个不同胚龄的人胚脑中分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，采用克隆球机械切割法可以长期培养。7周组中除高密度悬浮培养法生长不良，其它密度及培养法均有克隆球形成，13周组中仅中等密度悬浮法培养法及高密度贴壁培养法有克隆球形成。包被组各种密度培养均生长不良。二塑塑丝鲤红鲤丝竺塑墅巡竺燮丛暨渔渺燮梦娜之.超‘萝在各种不同的条件下从不同胚龄的胚脑中获得的神经干细胞在神经标志物的表达上无明显差异。结论:不同胚龄的人胚脑中均存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞，随着胚龄增大，培养难度逐渐加大，要快速有效地分离培养出神经干细胞，必须根据不同的胚龄采用不同的培养方法。第二部分:神经干细胞在成鼠脑内非神经发生区域的移植研究目的:将体外长期扩增的人神经干细胞移植入成年鼠的纹状体和大脑皮层，观察神经干细胞在非神经发生区内的存活、迁移和整合情况。方法:EGF，bFGF和uF联合应用从7周龄人胚前脑中分离出神经干细胞，体外长期传代扩增。取10一巧代的细胞，BrdU标记后在立体定向下通过细针移植入成年鼠的纹状体和大脑皮层，分别于移植后1周和6周取脑行冰冻切片，行BrdU和Nestin免疫荧光检测，以及NSE和GFAP免疫组化染色。结果:EGF，bFGF和LIF联合应用在体外能够较长期和大量扩增人神经干细胞，满足移植所需的细胞数量。移植后1周和6周，在所有动物的移植点均检测到BrdU阳性细胞，纹状体内的移植细胞最远的迁移距离大约有1一1.srn们n，皮层内的移植细胞迁移距离可以达到不同逐澎试翔经于细撇功分尹玲居荞掀尉力犷禅经发全区场功彦替卿之超萝2一2.5力以们n，神经干细胞移植后，移植后很快出现Nestin表达的下调，通过免疫组化发现分化后的细胞主要是胶质细胞，其中皮层中发现少量NSE阳性神经元细胞。结论:人胚神经干细胞可以在成鼠脑的非神经发生区域内存活和整合，其迁移和分化表现出位点特异性，具有限制性的迁移和多分化潜