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水稻(Oryza sativa L.)作为世界上最重要的粮食作物之一,基因组全序列的获得和大规模突变体库的建立,为水稻功能基因组学开展创造了良好条件。目前,许多涉及重要农艺形状的突变体已被鉴定,并且基因也陆续被克隆,这为了解水稻农艺形状形成的遗传基础做出了贡献。叶绿素缺失突变由于和光合作用密切相关,因此对这一类型农艺性状形成机制的研究有重要意义。本研究在获得大量水稻叶绿素缺失突变体基础上,开展了基因克隆和突变体鉴定工作,得到了一个参与光呼吸途径的基因(OsmSHMT),现将主要研究内容概括如下：1突变体表型鉴定通过对生长于培养室内的突变体和野生型观察发现突变体表型一开始并不明显,播种后15天叶绿色缺失表型才逐渐得以区分。在20天之前,突变体生长较野生型快,幼苗纤细,由于无法支撑进一步伸展的叶片,植株逐渐弯曲。2突变基因克隆利用GUS染色初步确定了突变表型可能与T-DNA插入有关,经过PCR-walking分离了突变体基因组T-DNA插入位点侧翼序列,通过比对后发现T-DNA插入水稻线粒体丝氨酸羟甲基转移酶基因(OsmSHMT),经PCI共分离验证,确定了被标记基因与突变表型共分离。最后,经互补实验证实OsmSHMT基因突变造成叶绿素缺失表型。3 OsmSHMT基因表达模式利用增强子捕获载体功能,经GUS染色探讨了OsmSHMT基因在各组织器官表达模式,结果表明该基因主要在叶片等具有光合功能的器官和部位表达,除叶片外,在根部也有强烈表达,而花器官内表达很弱。4 OsmSHMT.突变体在高CO2浓度下回复为野生表型由基因生物信息学分析认为OsmSHMT基因可能参与光呼吸途径,而光呼吸突变体都能在高CO2浓度下正常生长,不表现突变表型,为验证这一点,观察了OsmSHMT突变体在高CO2浓度环境中生长状况,结果证实OsmSHMT突变体属于光呼吸突变体。5 OsmSHMT基因原核表达在构建OsmSHMT-pET28a基础上,将其转入寄主菌BL21中,实现了OsmSHMT基因原核表达。6 OsmSHMT基因突变对光合作用影响利用叶绿素荧光技术,通过对突变体和野生型荧光慢诱导曲线测定发现,突变体荧光淬灭能力明显下降,高光强下尤其明显。通过观察qP和qN变化发现,qN在低光强下即表现出与野生型明显差异,而qP则在高光强下差异明显。经分析后认为,突变体qN降低可能与类囊体膜透性增加有关,qP可能受卡尔文循环影响而降低。7叶绿体结构及类囊体蛋白复合物变化叶绿体电镜切片表明,与野生型相比,突变体叶肉细胞内叶绿体数量减少,体积变小,基粒分布明显不均,基质类囊体破坏明显,嗜锇体增多。叶绿体类囊体膜蛋白复合物温和胶电泳结果表明,相比野生型,突变体光系统主要大分子复合物带型上移,这可能是由于受到氧化伤害后大分子复合物结构松散体积增大所致。综上所述水稻线粒体丝氨酸羟甲基转移酶基因(OsmSHMT)突变导致光呼吸途径受损,进而突变体卡尔文循环受到影响,光能不能被有效利用,过剩光能导致叶绿体活性氧升高,造成叶绿素、叶绿体膜系统及类囊体蛋白复合物被光氧化,叶绿体数量减少体积变小,最终,表型上表现为突变体叶绿素缺失性状。