芜菁花叶病毒山东分离物外壳蛋白基因的克隆和序列分析

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芜菁花叶病毒(TuMV)是植物病毒中最大的属——马铃薯Y病毒属的一个重要成员,在世界范围内广泛分布,能侵染43科、156属的300多种植物,其为害仅次于黄瓜花叶病毒(CMV)。本研究分离纯化了芜菁花叶病毒的山东分离物,对其生物学、血清学、细胞病理学和粒子形态学特征进行了研究。利用RT-PCR方法克隆了TuMV山东分离物的外壳蛋白(CP)基因,测定了它们的核苷酸序列、并将其与已报道的序列进行同源性比较和分析,最终确定了其归属地位,具体研究结果如下:1. 从山东省3地市感病的白菜和萝卜上分离到芜菁花叶病毒的6个分离物,分别命名为TuMV-SD1、TuMV-SD2、TuMV-SD3、TuMV-SD4、TuMV-SD5和TuMV-SD6。寄主反应特性表明,TuMV-SD1~6能侵染3科10种植物,TuMV-SD1在寄主细胞内形成风轮状内含体,外壳蛋白为3组分,分子量分别为45kd、38kd和14kd;提纯的病毒粒体为长线条状。体外抗性测定表明:TuMV-SD1~6稀释限点为1:3500~4000,体外存活期为96小时,失毒钝化温度为55℃~60℃。2.应用改进的芜菁花叶病毒的提取方法从病叶中提取病毒粒体,应用蛋白酶K法从病毒粒体中提取病毒RNA基因组,根据已报道的TuMV的CP基因序列,设计并合成了一对特异引物,利用RT-PCR法克隆了6个分离物的外壳蛋白基因,与克隆载体pUC19连接后通过热激法转化大肠杆菌DH5α。序列测定结果表明:TuMV-SD1~6的CP基因均为867个碱基,编码289个氨基酸。将测定序列递交GenBank,登录号分别为AF539407、AF539408、AF539409、AF539410、AF539411、AF539412。所得6个分离物的CP基因的核苷酸序列同源性较高,在97.0%~99.4%之间,系统进化分析表明:它们与Brassica(B)致病型分离物中的world-B组分离物的同源性最高(91.8%~100%),亲缘关系最近,从而从分子水平上将TuMV山东分离物划分为world-B组。
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