斑玉蕈(Hypsizigus marmoreus)又名真姬菇、蟹味菇,是一种食药用菌,其味道鲜美,肉质细嫩,口味甚佳,在日本有"香在松茸,味在玉蕈"之说,在国内也得到消费者的青睐。斑玉蕈是异宗配合的四极性担子菌,从接种到商品子实体采收的生产周期105天左右,比金针菇和杏鲍菇分别长60天和45天,因而工业化生产的效率相对较低。斑玉蕈长栽培周期主要归因于其独特的生理特点,即从菌丝生长向子实体生长转化前必须经过一个45天的菌丝体的后熟阶段,目前后熟阶段确切的生理作用尚不明确。另外,由于缺乏遗传操作手段和基因组学的研究背景,斑玉蕈的分子生物学研究进展缓慢。因此,本研究首先通过转录组技术对斑玉蕈不同发育时期的的差异表达基因进行了分析,确定漆酶基因家族作为后续研究对象;然后,通过外源添加漆酶抑制剂曲酸从生理水平上研究了漆酶在斑玉蕈子实体发育中的功能;再次,在斑玉蕈中构建了农杆菌介导的传转化体系;最后,利用构建的遗传转化体系,从分子水平上研究了漆酶基因家族在斑玉蕈子实体发育中的功能,以期缩短斑玉蕈的发育周期。主要结果为以下几个方面:1.转录组技术筛选和子实体发育相关的差异表达基因:为了筛选和斑玉蕈子实体发育相关的关键基因,本研究利用转录组测序技术对斑玉蕈的菌丝扭结期、转色期、原基期和子实体期四个发育时期进行了转录组测序。转录组测序后,通过两两样本进行比较,筛选出样本之间的差异表达基因,并对这些差异表达基因在斑玉蕈子实体发育中可能的功能进行了分析。研究发现斑玉蕈有14种漆酶同工酶基因,并命名为lcc1到lcc14。这14种漆酶基因在斑玉蕈的四个不同发育时期的表达模式差异很大,预测它们在斑玉蕈子实体发育中发挥着重要的功能。我们将漆酶基因家族在斑玉蕈子实体发育中的功能作为后续的研究对象。2.漆酶在斑玉蕈子实体发育中的功能:为了研究漆酶在斑玉蕈子实体发育中的功能,本研究首先选择了漆酶的专一性抑制剂曲酸,通过外源添加曲酸的方式,初步从生理上考察了漆酶与斑玉蕈菌丝生长和子实体发育的关系。外源添加漆酶抑制剂可以显著地抑制斑玉蕈漆酶活性和菌丝生长,说明漆酶在斑玉蕈的营养生长阶段与菌丝生长存在相关性。另外,外源添加曲酸在培养料中不仅可以诱导斑玉蕈原基提前发生,同时可以促使斑玉蕈子实体提前成熟。当菌丝培养时间是60天和85天和添加曲酸的浓度是10 mM时,60天的子实体单瓶产量与85天的相当。由这个结果可以说明外源添加漆酶抑制剂可以有效地缩短斑玉蕈菌丝培养时间25天。同时,研究发现添加曲酸后漆酶活性呈现先降低后提高的趋势,即在菌丝恢复期被抑制和在菌丝转色期和原基期被提高,可能是因为外源添加曲酸使得漆酶基因家族大部分成员的转录水平在菌丝恢复期被下调和在转色期和原基期被上调。由以上结果可以得出上调漆酶基因家族转录水平可以提高漆酶活性,进而可以促进菌丝生长、原基发生、子实体成熟和缩短斑玉蕈菌丝培养时间。3.农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化体系的建立:为了更深入地研究漆酶基因在斑玉蕈子实体发育中的功能,本研究首次在斑玉蕈中建立了根癌农杆菌介导的遗传转化体系,并在这一体系的基础上实现了漆酶基因的过量表达。首先通过根癌农杆菌LBA4404菌株和斑玉蕈原生质体细胞的共培养以及潮霉素B的抗性筛选,获得了一批具有潮霉素抗性的斑玉蕈转化子菌株,并通过PCR扩增潮霉素基因(hph)与斑玉蕈gpd启动子序列的融合片段(gpd-hph和Southern Blot实验证实潮霉素基因片段hph已成功整合进斑玉蕈转化子的基因组中。然后通过对转化中的各参数进行优化以期获得最大的转化效率。实验中利用农杆菌菌株EHA105,在农杆菌与原生质体比例为1000:1,添加乙酰丁香酮浓度为0.25 mM,于26℃共培养24h的条件下,我们得到约150个转化子/105原生质体的较高转化效率。接下来本研究通过应用斑玉蕈的gpd基因启动子、香菇的gpd基因启动子以及灵芝的gpd基因启动子驱动抗性标记基因表达,从而比较不同来源启动子对转化效率的影响,研究发现以斑玉蕈gpd基因启动子驱动抗性标记基因表达的载体获得了最高的转化效率,而应用香菇和灵芝的gpd基因启动子获得转化效率都低于斑玉蕈gpd基因的启动子。这一结果证明了使用内源启动子驱动外源基因表达能够显著提高转化效率。同时,该遗传转化体系的建立为本课题接下来对相关功能基因的研究奠定了基础。4.为了进一步研究漆酶基因在斑玉蕈子实体发育中的功能,本研究利用已经构建好的斑玉蕈的遗传转化体系对漆酶基因lcc1进行了过量表达研究。研究中构建了过量表达载体Hm-Lcc1,并通过应用根癌农杆菌介导的斑玉蕈转化方法,将Hm-Lcc1过量表达载体转入斑玉蕈中。随机挑取5株获得的过表达转化子OE-Lcc1s,进行RT-PCR分析研究发现OE-Lcc1-1中lcc1基因的表达量约为野生型菌株SIEF3133的3倍;其余三株OE-Lcc1s中lcc1基因的表达量也均在野生型菌株SIEF3133的2倍以上。为了深入地研究过量表达转化子对表型的影响,我们分别检测了它们的胞外漆酶活性和菌丝生物量,发现过量表达转化子的漆酶活性和生物量都有不同程度地提高。对转化子进行结实性实验发现,过量表达转化子菌丝在培养料中的生长速度明显快于野生型菌株和原基发生也比野生型菌株提前。由这些结果说明提高漆酶基因lcc1转录水平可以提高漆酶活性,进而加快菌丝在培养料中的生长速度和促进原基提前发生。综上所述,本研究首次在斑玉蕈中建立了农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化体系,为后续研究基因在斑玉蕈子实体发育中的功能奠定基础;通过对漆酶基因家族在斑玉蕈子实体发育中的功能研究发现,提高胞外漆酶活性可以促进斑玉蕈菌丝生长、原基提前发生和缩短菌丝培养时间。