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甲霜灵(metalaxyl)是一种酰胺类广谱抗菌剂,对水霉病有良好的防治效果。随着孔雀石绿的禁用,甲霜灵作为替代的新型药物,在水产养殖业中的使用日益频繁。甲霜灵在植物、哺乳动物以及环境中的残留、代谢规律及安全评估研究已有探索,在水产品中的相关研究却鲜有报道。本文以异育银鲫(Carassius auratus gibelio)作为主要实验对象,建立在水产动物中甲霜灵残留的检测方法、探索甲霜灵在水产动物体内的消除、蓄积规律以及对甲霜灵在水产养殖中使用的安全性进行评估,为甲霜灵在水产养殖中的合理运用提供科学的理论参考,亦为甲霜灵在水产品中的残留监测提供高效的技术支持。主要研究内容如下:1.建立了在水产品可食用组织中甲霜灵的残留检测技术,包括基于免疫学的胶体金免疫层析试纸条(Colloidal gold enhanced immunochromatog raphy assay,GICA)现场快速检测初筛方法与利用高效液相色谱仪(High performance liquid chromatography,HPLC)复检的联合检测技术。利用甲霜灵单克隆抗体高亲和力、特异性强的特点,组装成胶体金免疫层析试纸条。经测试,试纸条检测甲霜灵标准溶液时最低检测限为5mg/L,与恩诺沙星、磺胺甲恶唑等8种药物无交叉反应。检测异育银鲫、凡纳滨对虾、菲律宾帘蛤三种水产品时,肉眼可见的检测限分别为2mg/kg、2mg/kg、1mg/kg。肉眼判定结果存在一定误差,再利用HPLC进行复检,方法在0.05μg/m L-5.0μg/m L范围内呈现良好的线性关系,回归方程为y=35.302x+0.311236,相关系数为0.99,检测限为20μg/kg,定量限为30μg/kg。初筛方法操作简单,不需依托昂贵仪器以及专业操作人员且缩短了检测时间,适用于现场水产品样品中甲霜灵残留的快速筛查。复检方法操作自动化、用时短、准确度和灵敏度高,两种方法联合检测提高了甲霜灵残留检测的效率及准确性。2.室温(15℃)下进行养殖用药,利用HPLC检测异育银鲫血液、肝脏、肾脏及肌肉中甲霜灵的浓度变化,探索了9 mg/L、36 mg/L浓度甲霜灵浸泡处理后,甲霜灵在异育银鲫体内的代谢过程及残留消除规律。结果表明:两个甲霜灵浓度处理组中,异育银鲫各组织中物浓度随时间变化趋势一致,呈现“双峰现象”。血液、肝脏、肾脏及肌肉在药物处理8h,2h,8h,8h首次达峰,低浓度组达峰浓度分别为9.47 mg/L,117.53 mg/kg,56.94 mg/kg,64.19 mg/kg;高浓度组分别为39.24 mg/L,317.59 mg/kg,278.22 mg/kg,281.1mg/kg;在128h又出现第二个峰,第二峰值的药物浓度均低于首次峰值。据达峰时间及药物作用部位,建议甲霜灵药浴时长为2h。甲霜灵在异育银鲫的肝脏、肾脏、肌肉组织中有明显的富集,蓄积量肝脏>肾脏>肌肉,甲霜灵在肝脏中最早达峰、峰值浓度最高,认为肝脏是甲霜灵在异育银鲫体内最主要的蓄积靶器官,并认为肝肠吸收或首关效应是可能导致出现重吸收现象的主要原因。3.开展了甲霜灵在异育银鲫体体内的安全性研究。0 mg/L、9 mg/L、36 mg/L甲霜灵药浴2h后,通过制作组织切片、测定抗氧化酶活性、测定抗氧化酶及药物代谢酶相关基因的表达量,探究低浓度及高浓度甲霜灵对异育银鲫的安全性。取异育银鲫的肝、肠、肾组织进行固定,制作切片、染色后观察甲霜灵对异育银鲫各组织造成的损伤情况,测定异育银鲫总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化氢酶(GPX)等抗氧化及丙氨酸氨基转移酶(ALT)肝功能损伤等生物指标,同时利用荧光定量PCR测定其SOD、GPX两个抗氧化酶以及P450 1A、GABA A两个药物代谢相关酶的基因表达水平。研究发现低浓度(9 mg/L)及高浓度(36 mg/L)甲霜灵对异育银鲫的肾脏组织均未造成明显的组织损伤;对肠道及肝组织造成明显损伤,主要出现肠道绒毛断裂、肝细胞空泡化现象。测定抗氧化酶活性发现相对于空白组,高浓度处理组能使得异育银鲫的总抗氧化能力显著升高(p<0.05),低浓度MDA表达水平显著升高(p<0.05),但两组ALT表达情况均并无显著变化(p>0.05)。抗氧化酶及药物代谢酶相关基因的表达量显示高浓度甲霜灵使得异育银鲫肝脏中SOD、GPx以及GABA A表达量显著升高(p<0.05),即该条件下甲霜灵可能通过GABAA抑制氧化应激,提高异育银鲫的抗氧化能力,对异育银鲫有一定的保护作用。