研究背景神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是起源于胚胎期神经嵴的儿童常见恶性肿瘤之一,占儿童恶性肿瘤的8-10%,年发病率为(0.3-5.5)/10万,仅低于白血病和中枢神经系统肿瘤,在小儿恶性肿瘤中居第三位。本病恶性程度高,侵袭力强,进展快,诊断时70%以上NB患者存在远处转移,一般通过淋巴或血液途径转移至骨髓、骨、肝、淋巴结核皮肤等。目前尽管采用了多学科的综合治疗手段,Ⅲ-Ⅳ期NB的预后还是很差,5年无病生存率仍小于40%,且总的病死率占儿童肿瘤死亡率的15%。为此,人们不断地在探索对NB新的治疗方法。当前,对NB治疗主要基于肿瘤的风险分级、分期进行,在中高危组的治疗模式主要为大剂量的诱导化疗、手术、放疗、清髓后自体骨髓移植及生物免疫治疗等多学科、多专业的综合治疗,而以顺铂、VP16、长春新碱、阿霉素、环磷酰胺等细胞毒药物为代表的全身化疗一直占有核心地位。化疗直接以杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞生长为目标,同时对正常组织细胞也起到不同程度的破坏作用,其毒副作用严重影响了患儿的生活质量及生长发育；而且肿瘤对化疗药物的耐受也越来越受到关注,研究表明50%以上的高危NB儿童出现化疗耐药而复发。化疗药物单药剂量较大,副作用明显,相对容易出现耐药,而联合用药可以减少或避免这种情况,这已成为众多学者的共识。因此,在开发新药的同时,探索联合用药方式及其机制成为研究的重点之一。NB具有自我分化、消退逆转的独特生物学特性。自然退化多发生在新生儿及婴儿期,对于肿瘤分期为4S期患儿,虽然出现远处转移,却存在较高的自愈率。因此,人们不断研究NB的诱导分化治疗。体外研究发现,能诱导NB分化的物质有维甲酸(retinoic acid,RA)、神经生长因子、干扰素-γ、白介素-2、苯乙酸钠等,而研究最多的为RA。研究表明RA通过诱导神经母细胞瘤细胞凋亡和(或)诱导细胞分化而发挥抗瘤作用。RA存在全反式维甲酸(all-transretinoic acid, atRA)、9-顺式维甲酸(9-cis retinoic acid,9-cis RA)、13-顺式维甲酸(13-cis retinoic acid,13-cis RA)三种异构体。美国儿童肿瘤学组(Children’s Oncology Group, COG)的一项随机临床试验研究显示高危NB在巩固化疗后使用13-cis RA显著改善了总的生存率和无病生存率。此外,NB细胞株体外实验表明：9-cis RA能诱导维甲酸受体(RAR)表达、高亲和地结合维甲酸X受体(RXR);诱导分化不发生逆转,同时又有抗增殖、引起细胞凋亡的作用；且Chu等发现9-cis RA相比13-cis RA对NB有更强的抗增殖效应。因此9-cis RA的应用前景被更看好。国内同行多集中于atRA研究,国外也多为13-cis RA研究,对9-cis RA涉及NB方面的研究甚少。近年来,随着分子生物学技术的发展,对NB的分子水平的研究也不断提高。许多分子生物学指标已广泛应用于NB的诊断和治疗。目前对NB分子学的研究表明肿瘤细胞的DNA、RNA倍体、MycN和多重耐药基因(multidrug resistance genel,MDR1)、TrkA等基因的表达情况与NB的发生、发展、转移、消退及预后密切相关。特别是MycN基因高扩增已经是NB公认的预后不良因素,资料显示20%的NB和40%的晚期NB带有MycN扩增。MycN扩增说明肿瘤已属晚期,疾病进展快,预后差。MycN扩增多伴随MycN在mRNA及蛋白水平的高表达,而MycN高表达产物促进肿瘤细胞的生长与增殖,抑制分化及凋亡。因此下调MycN扩增型NB的MycN表达是临床研究关注点。NB细胞耐药性是化疗失败和肿瘤复发的重要原因,严重影响预后。肿瘤细胞产生耐药的机制较复杂,而MDR1表达增强是肿瘤细胞耐药的一个重要原因。因此,我们选择MycN、MDR1基因的联合改变作为药物疗效评估的指标。本实验选择9-cis RA联合各细胞毒药物作为联合用药方式,而国内外关于9-cis RA联合细胞毒药物作用NB的研究资料甚少。以下研究报道成为本实验设计的基础：9-cis RA联合细胞毒药物体外对SH-SY5Y细胞株抗增殖及诱导凋亡方面有协同作用,但进一步分子机制不详细；9-cis RA联合γ-干扰素体外作用SK-N-SH细胞株协同下调MycN、MDR1基因表达；国外报道13-cis RA联合细胞毒药物体外作用Kelly细胞株能下调MycN表达。但9-cis RA联合细胞毒药物作用于MycN扩增型NB的生物学效应目前仍不清楚。本实验采用IMR32细胞株,为已知的MycN:扩增型细胞株,且表达少量S型细胞,具有许多恶性NB分子生物学特点,其研究结果将更具代表性；而国内研究报告中多采用SK-N-SH或SH-SY5Y等非MycN扩增细胞株。此外,本实验还充分利用CCK-8(Cell Counting Kit-8).细胞流式仪(Flow Cytometer, FCM)、实时荧光定量PCR (real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction, FQ-PCR)当今国际上最先进的生物学技术、方法、设备,实验设计严谨科学,可行性强,实验结果可靠性高,具有一定的临床指导价值。研究目的体外观察9-cis RA联合各细胞毒药物对MycN扩增型神经母细胞瘤细胞的生长抑制、凋亡坏死及Myc、MDR1基因表达的影响,为临床合理用药提供依据。研究方法实验分为空白对照组、单药组(9-cis RA及4种细胞毒药物)和双药组(9-cis RA分别与各细胞毒性药物组合)。9-cis RA作用终浓度为15μmol/L;长春新碱(vincristine,Vcr)、顺铂(cis-dichlorodiammine platinum,cDDP)、足叶乙甙(etoposide,VP16)、阿霉素(adriamycin, Adr)作用终浓度采用IC(40±2),分别为cDDP2000μg/L, Adr1000μg/L, Vcr500μg/L, VP16500μg/L。IMR32细胞培养于含10%FBS、双抗(1：100)的MEM培养基中,细胞培养箱中37℃,5%CO2培养,每2天换液一次,每4-5天传代一次。取对数生长期细胞按2.5×105/ml密度并换为含1%血清培养基接种至96孔板(100μl)、12孔板(1m1)、6孔板(2m1)中,孵育24h后,按上述药物浓度标准进行单药或双药联合对各组细胞给药,继续培养24h后进行镜下观察及相关实验指标检测：1)倒置相差显微镜下观察细胞形态学分化变化；2)用CCK-8比色法测定肿瘤细胞OD值,计算肿瘤细胞生长抑制率(细胞生长抑制率(%)=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%)；3)采用FCM钙依赖性磷脂结合蛋白V和碘化丙啶(Annexin V/P)双染法检测肿瘤细胞的凋亡率；4)用反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和FQ-PCR方法检测MycN、MDR1基因mRNA的表达。其基因表达量用实验组/对照组=2-△△Ct计算。统计方法采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,数据采用(x±s)表示,行析因方差分析,两两比较用LSD-t险验,P<0.05为有统计学意义。研究结果药物作用24小时后：1)镜下观察9-cis RA单独作用IMR32细胞后较对照组细胞形态学分化明显,表现为细胞变圆,轴突细胞增多,且轴突变细延伸较长；而细胞毒药物及联合用药组细胞大部分失去贴壁性,漂浮,轴突短或消失；2)细胞生长抑制率各双药组高于相应单药组(P<0.01),9-cis RA+Adr组高于9-cis RA+cDDP组和9-cis RA+VP16组(P<0.05)。3)细胞凋亡率双药组高于相应单药组(P<0.01),9-cis RA+cDDP组高于其它双药组(P<0.05)。4) MycN基因mRNA的表达量各药物组低于对照组(P<0.05),各双药组均低于相应单药组(P<0.05),9-cis RA+Vcr组低于其它双药组(P<0.01); MDR1表达除9-cis RA单药组外各组均高于对照组(P<0.05),各双药组均低于相应细胞毒单药组(P<0.01),9-cis RA+Adr组明显高于其它双药组(P<0.01)研究结论9-cis RA单独可诱导IMR32细胞分化,而联合细胞毒药物后24小时内没观察到明显地细胞分化。9-cis RA联合各细胞毒药物对NB生长抑制、凋亡及下调MycN表达有明显的协调作用；仅9-cis RA单独可下调MDR1表达,双药联合及细胞毒单药均不同程度上调MDR1表达。但相比之下,9-cis RA+cDDP有更好的凋亡协同效应,9-cis RA+Vcr则更有效减少MycN表达,因此综合分析9-cisRA+Vcr、9-cis RA+cDDP可作为NB临床联合用药的不错选择；而9-cis RA+Adr虽有较高的生长抑制协同作用,但导致高水平的MDR1表达则不作为联合用药的推荐。然而,体内环境是复杂多变的,影响药物效应的机制更为复杂,结论还有待于体内试验进一步研究证实。