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第一部分：目的：文献报道隐丹参酮(CTS)可以改善心肌纤维化,那么其对肾纤维化是否有作用呢?该部分主要研究隐丹参酮对肾脏损伤和间质纤维化是否具有保护作用。方法：40只C57/BL6小鼠建立单侧输尿管梗阻(UUO)模型,按以下处理分为四组：(1)假手术组；(2)假手术+50mg/kg/d CTS处理组；(3)UUO组；(4)UUO+50mg/kg/d CTS处理组；术后7天取材。HE染色检测肾小管损伤情况,Masson染色检测间质中胶原沉积,免疫组化和western blot检测细胞外基质沉积。CCK-8检测CTS对肾小管上皮细胞的增殖和毒性影响。体外培养大鼠肾小管上皮细胞NRK52E,分别给予对照,5ng/ml TGF-β1,5ng/ml TGF-β1+lOuM CTS和5ng/ml TGF-β1+20uM CTS处理。24h后Western Blot和Real-time PCR检测Collagen-1和Fibronectin的蛋白和mRNA水平的表达。结果：CCK-8结果显示不同浓度CTS处理组与对照组相比,细胞活性无差异。假手术+50mg/kg/d CTS组肾脏呈正常的形态学表现,单纯UUO处理组肾小管上皮扁平塌陷,小管腔扩张,间质中细胞浸润明显,小管损伤指数为2.30±0.35；间质胶原沉积比例约为13.95±1.68。而UUO+50mg/kg/d CTS组肾小管上皮塌陷,小管扩张数目与程度明显减轻,小管损伤指数为0.96±0.25,间质胶原沉积比例为7.38±1.28,与单纯UUO组相比,P<0.05。Western blot和免疫组化结果均显示,输尿管梗阻7d后肾脏中Collagen-1和Fibronectin的表达显著增高；CTS治疗可显著抑制间质中Collagen-1和Fibronectin的表达,与单纯UUO模型组相比差异有统计学意义。5ng/ml TGF-β1处理大鼠肾小管上皮细胞可上调Collagen-1和Fibronectin的表达,而10uM和20uM CTS处理可显著抑制Collagen-1和Fibronectin的mRNA和蛋白水平的表达,组间差异有统计学意义。结论：CTS可改善肾小管间质损伤和间质中细胞外基质的沉积,改善肾小管间质纤维化。第二部分：目的：上皮间质转化(EMT)是引起肾纤维化重要的机制之一,本部分主要探讨CTS是否可以改善上皮间质转化。方法：构建UUO小鼠动物模型,分别给予对照和50mg/kg/d CTS处理。免疫组化和Western Blot分别检测不同处理动物模型组a-SMA和E-cadherin蛋白表达。体外培养大鼠肾小管上皮细胞NRK52E,分别给予对照,5ng/ml TGF-β1, 5ng/ml TGF-β1+lOuM CTS和5ng/ml TGF-β1+20uM CTS处理,24h后Western Blot和细胞免疫荧光检测α-SMA和E-cadherin的表达。结果：术后7天取材后,免疫组化和Western Blot结果均显示,输尿管梗阻7d后肾脏中α-SMA表达升高而E-cadherin的表达显著降低；CTS治疗可逆转这一结果,与单纯UUO模型组相比差异有统计学意义,P<0.05。体外实验结果显示,Western Blot和细胞免疫荧光显示TGF-β1刺激肾小管上皮细胞可上调α-SMA的表达而抑制E-cadherin的表达,而10uM和20uM CTS治疗可逆转这一结果。结论：CTS可抑制肾小管上皮细胞的上皮间质转化。第三部分：目的：TGF-β1和MAPK通路是调节肾间质纤维化和上皮间质转化最重要的信号通路,本部分主要探讨CTS抑制上皮间质转化的主要机制。方法：Western blot检测不同处理组肾脏组织TGF-β1/Smads通路和MAPK通路中相关蛋白的表达。体外培养大鼠肾小管上皮细胞NRK52E,分别给予对照,5ng/mlTGF-β1和5ng/ml TGF-β1+20uM CTS处理,Western blot检测TGFβ/Smads通路和MAPK通路中相关蛋白的表达,细胞免疫荧光检测Smad2, Smad3和Smad4的核转位。构建pcDNA3.1(+)-Smad3真核表达载体和pGL3-integrin β1启动子序列质粒共转染NRK52E细胞,用荧光素酶报告基因检测Smad3对integrinβ1启动子区域的调控作用。用染色质免疫沉淀检测Smad3和integrin β1启动子区域的特异性结合。结果：术后7天取材后,单纯UUO组p-P38,p-ERK,p-JNK,p-Smad2,p-Smad3, Smad4的表达显著增高；相比于单纯UUO组,UUO+50mg/kg/d CTS组P-P38, p-ERK, p-JNK, p-Smad2, Smad4没有明显差异,P>0.05；而p-Smad3的表达却显著受到抑制。与动物实验结果类似,TGF-β1可上调NRK52E细胞中p-Smad2, p-Smad3;但CTS仅可明显抑制p-Smad3的表达。Smad2, Smad3和Smad4细胞免疫荧光结果显示20uM CTS可显著抑制Smad2, Smad3和Smad4的核转位。荧光素酶报告基因结果显示Smad3可以增强integrin β1的转录活性,20uM CTS可抑制这一过程。同时,染色质免疫沉淀结果显示20uM CTS可以抑制Smad3与integrin β1启动子区域的结合。结论：1.CTS可通过抑制Smad3的磷酸化而抑制上皮间质转化,同时其可以抑制Smads复合体的核转位。2.CTS可以抑制Smad3对integrin β1的转录,且抑制Smad3与integrin β1启动子区域的结合。