论文部分内容阅读
近年来,基因疗法已成为癌症治疗的重要手段之一,其中,小干扰RNA(siRNA)药物已受到医药领域广泛关注。但是,siRNA药物在体内稳定性差、易被核酸酶降解,半衰期短,这些缺陷限制了 siRNA的临床应用。因此,发展能够高效递送siRNA药物的载体已成为本领域急需解决的难题。本课题构建了能够高效递送siRNA的非病毒载体,并应用筛选出的载体加载siRNA制备纳米粒,进行体内外抗肿瘤的研究。首先,将6-聚精氨酸-6-聚组氨酸(H6R6)短肽偶联到壳聚糖高分子链游离氨基末端,制备H6R6-CS共聚物作为siRNA递送载体,并利用1H-NMR分析方法对其结构进行鉴定。然后选用不同类型的细胞,通过MTT方法对H6R6-CS共聚物进行细胞毒性评价,研究结果表明,合成的H6R6-CS共聚物安全无毒。采用酸碱滴定法考察H6R6-CS共聚物的缓冲能力,发现其在pH3.5-6.5之间存在明显缓冲能力。以复凝聚法制备载siRNA的纳米粒,并对其表面形态、粒径、Zeta电位、稳定性等理化性质进行考察,结果显示所制备的纳米粒的平均粒径在175nm左右,Zeta电位在+14.8mV左右、粒径分布范围较窄,纳米粒呈圆球状,且表面光滑。选择能够稳定表达Luciferase基因的4T1细胞,考察H6R6短肽修饰后的纳米粒对内源基因的表达的抑制情况,研究结果表明,其抑制率可达50%。同时利用流式细胞术和激光共聚焦显微镜法考察纳米粒的入胞情况,利用激光共聚焦法考察了纳米粒的溶酶体逃逸能力,研究结果表明,H6R6短肽修饰后的纳米粒被肿瘤细胞的摄取率显著增强,并在转染6h后,能迅速逃离溶酶体。选择靶向Survivin和BRAF基因的功能性siRNA制备纳米粒,研究纳米粒对4T1和A375两种肿瘤细胞的体外杀伤效果。研究结果表明:转染48h后,两种纳米粒抑制细胞增殖的效率达到最大,分别为49%和51%。细胞凋亡实验结果表明:修饰后的纳米粒能够显著诱导肿瘤细胞凋亡。选择靶向Survivin和BRAF基因的功能性siRNA制备纳米粒,研究纳米粒对乳腺癌和黑色素瘤的抑制效果。研究结果显示:H6R6-CS/siRNASur纳米粒能够显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的增长和转移,并能有效延长荷瘤小鼠的生存周期。此外,选择靶向BRAF基因的功能性siRNA制备纳米粒,对荷瘤裸鼠进行瘤内注射观察其对黑色素瘤的抑制情况,研究结果显示:H6R6-CS/siRNABRAF纳米粒对黑色素瘤同样具有显著抑制作用。