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目的:本课题以酸枣仁总皂苷为研究对象,基于UPLC-Q-Orbitrap-MS技术全面表征其化学成分;模拟体内肠道菌群代谢转化过程,建立具有维持稳定代谢能力的肠道菌群体外培养体系;优化样品前处理方法,分析酸枣仁总皂苷转化前后原型成分及代谢产物,并推测可能的代谢转化途径;运用高通量测序技术分析酸枣仁总皂苷对失眠肠道菌群的调控作用;从整体动物水平评价酸枣仁总皂苷转化产物的改善睡眠活性,探讨酸枣仁皂苷代谢产物是其潜在效应成分的可能性。方法:1.酸枣仁总皂苷制备及化学成分的表征。以酸枣仁为原料,采用乙醇提取大孔树脂分离纯化的方法获得酸枣仁总皂苷,利用紫外分光光度法测定酸枣仁总皂苷的纯度,运用HPLC-ELSD法测定酸枣仁皂苷A、B的含量,并通过液-质联用技术对酸枣仁总皂苷中的化学成分进行表征。2.肠道菌群对酸枣仁总皂苷体外代谢转化研究。以人新鲜粪便作为肠道菌群的来源,菌液OD 600值和酸枣仁皂苷成分的转化能力为评价指标,对培养时间和培养基进行考察筛选,建立具有维持稳定代谢能力的肠道菌群体外培养体系。在此基础上,优化代谢转化样品预处理的方法,采用UPLC-Q-Orbitrap-MS技术鉴别酸枣仁皂苷转化前后原型成分及代谢产物,阐明正常和失眠病人肠道菌群对酸枣仁总皂苷的代谢规律,对代谢速率和代谢反应途径进行分析比较,为明确酸枣仁皂苷的效应物质提供基础。3.酸枣仁总皂苷对肠道菌群的调控作用研究。将正常人肠道菌群、失眠病人肠道菌群及酸枣仁总皂苷干预失眠病人肠道菌群的样品应用Illumina MiSeq测序平台进行高通量测序,根据测序结果分析不同样本的多样性、菌种组成及物种差异,分析肠道菌群与酸枣仁皂苷代谢产物的相关性,并筛选出正常和失眠患者的差异性菌种,明确酸枣仁总皂苷通过调控肠道菌群改善失眠的作用。4.酸枣仁总皂苷转化产物改善小鼠睡眠活性研究。利用大孔树脂纯化酸枣仁总皂苷肠道菌群转化产物,运用HPLC-ELSD法测定转化产物中酸枣仁皂苷A、B的含量。利用戊巴比妥钠小鼠模型评价转化前后酸枣仁总皂苷改善睡眠活性,探讨酸枣仁皂苷起镇静催眠作用的有效部位。结果:1.本研究共制备酸枣仁总皂苷35 g,纯度为45.75%,酸枣仁皂苷A、B含量分别为11.83%、6.71%。基于UPLC-Q-Orbitrap-MS技术共鉴定酸枣仁皂苷20个,其中17个为四环三萜类,3个为五环三萜类。2.以培养时间为9 h,培养基为GAM,建立具有维持稳定代谢能力的肠道菌群培养体系。酸枣仁总皂苷的代谢转化样品以SPE C18固相萃取小柱吸附,水洗后先用40%甲醇冲洗,再用100%甲醇洗脱,100%甲醇洗脱液蒸干后上样分析。经UPLC-Q-Orbitrap-MS分析,共鉴定到酸枣仁皂苷代谢产物38个,其中正常人肠道菌群样品中鉴别出代谢产物34个,病人肠道菌群样品中鉴定出代谢产物36个,糖基水解反应是主要的代谢途径,其次正常人肠道菌群中可发生糖基反应、去氧反应和脱羧反应,病人肠道菌群中可发生去氧反应和氧化反应。3.与正常人肠道菌群相比,失眠病人肠道菌群alpha多样性降低,经酸枣仁总皂苷干预后,多样性显著升高。在门水平,占主要丰度的Firmicutes(厚壁菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Actinobacteria(放线菌门)和Bacteroidetes(拟杆菌门)都有所回调(P<0.001),在属水平上,酸枣仁总皂苷干预后显著上调的有15个属,显著下调的有7个属。通过LefSe和随机森林分析,将Turicibacter(绿脓杆菌属)和Clostridium(梭菌科梭菌属)作为失眠病人组生物标志物种,Dorea和Bacteroides(拟杆菌属)作为正常组生物标志物种。将有显著差异的肠道菌群与酸枣仁皂苷代谢产物进行相关性分析,明确肠道菌群与酸枣仁总皂苷的相互作用。4.将酸枣仁总皂苷9.00 g进行肠道菌群转化,转化后样品采用大孔树脂纯化,制备酸枣仁总皂苷代谢转化产物共7.03 g,酸枣仁皂苷A、B含量分别为0、8.16%。结果显示酸枣仁总皂苷及转化产物均可减少小鼠自主活动,延长戊巴比妥钠阈剂量的小鼠睡眠时间,减少小鼠睡眠潜伏期,差异均有统计学意义,且潜伏期和睡眠时间都呈现剂量依赖。表明酸枣仁总皂苷及转化产物均有镇静催眠作用,但两者之间没有统计学差异,总体转化产物较酸枣仁总皂苷药效趋势好。结论:本研究建立了基于UPLC-Q-Orbitrap-MS技术的酸枣仁皂苷鉴别策略,表征酸枣仁总皂苷中成分;模拟体内肠道菌群代谢转化过程,建立具有维持稳定代谢能力的肠道菌群体外培养体系;优化样品前处理方法,研究酸枣仁总皂苷转化前后原型成分、代谢产物及代谢规律;运用高通量测序技术分析酸枣仁总皂苷对失眠肠道菌群的影响,筛选能有效区分正常和失眠症的标志菌种;从动物水平,对酸枣仁总皂苷转化产物进行活性评价,明确酸枣仁皂苷代谢产物是潜在有效成分部位。本研究为基于肠道菌群对酸枣仁皂苷药效物质基础的确定和失眠症的靶向治疗提供依据。