【背景】乙肝病毒相关性疾病包括由乙肝病毒(HBV)引起的急慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化及肝细胞肝癌等,严重威胁着人类的健康。我国是肝病大国,乙型肝炎病毒携带者有1.2亿之众,约占我国全部人口的9%。慢性乙肝和肝硬化患者有3000万之多。乙型肝炎一旦慢性化,10-20%可发展为肝硬化,1%-5%可演变为肝癌。我国每年因肝硬化和肝癌死亡人数超过30万,其中肝癌死亡人数达18万,目前这一数目还呈上升趋势。肝病已经成为当今威胁中国人口健康的主要疾病之一,数量巨大的慢性肝病患者的存在,以及每年新发现肝炎病例的出现,给国家经济带来了沉重的负担。尽管干扰素和核酸类似物的应用可以抑制乙肝病毒在体内的复制,但不能有效清除体内的乙肝病毒,同时长期用药的各种副作用以及病毒突变和停药后的复发等严重影响治疗效果,因此寻找新的抗病毒治疗方法和新的抗病毒治疗靶点是当务之急。microRNA (miRNA)是近年来发现的一类广泛存在于动植物体内的非编码小RNA,在转录后水平负性调控基因的表达。据预测,每个miRNA可以调控超过200个基因的表达,人类基因组序列可以编码超过1000个以上的miRNAs,这些miRNAs可调控超过1/3的蛋白编码基因的表达,影响着几乎所有的信号通路。miRNA已被证实不仅广泛参与个体发育,器官形成,物质代谢等生理过程,且和肿瘤发生、病毒复制等病理过程密切相关。病毒复制和宿主细胞的多种因素有关,因此病毒生命周期也极有可能利用miRNA这种调控方式。事实上,已有确切的证据证明病毒基因组本身能编码大量的miRNA,通过和病毒或宿主细胞编码的靶基因结合,而达到免疫逃逸或对抗宿主细胞的抗病毒效应。同时宿主miRNA能调节病毒基因的表达而调控病毒的复制,病毒利用这些宿主细胞的miRNA通路而促进病毒在体内的复制。在宿主细胞和病毒的对抗网络中,miRNA发挥极其重要的调节作用。因此,我们推测存在着这么一类miRNA分子,能通过调节HBVmRNA、HBV编码的蛋白质,或者是宿主细胞内病毒复制相关的蛋白质的表达,而调控HBV在体内的复制。到目前为止,miRNA在乙肝病毒复制中的作用及机制尚未见报道。【目的】探讨内源性的miRNA在乙肝病毒复制中的调节作用及其分子机制,以期从新的角度阐明乙肝病毒体内复制的机制,并为寻找新的抗病毒治疗靶点提供理论依据。【方法】1.通过miRNA芯片检测乙肝病毒稳定复制的肝癌细胞系HepG2.2.15及其亲本细胞HepG2的miRNA表达谱,寻找差异表达的miRNA;2.利用real-time RT-PCR法对miRNA芯片结果进行验证;3.通过细胞转染,利用miRNA特异的前体寡核苷酸分别上调HepG2.2.15细胞中miRNA的表达,miRNA特异的反义寡核苷酸抑制物分别下调HepG2.2.15细胞中miRNA的表达;4.通过MTT试验检测miRNA对肝癌细胞体外增殖能力的影响;5.通过实时荧光PCR检测miRNA对乙肝病毒DNA水平的影响,实时荧光PCR检测miRNA对乙肝病毒mRNA水平的影响,ELISA检测miRNA对乙肝病毒蛋白水平的影响;6.利用生物信息学网站或软件预测miR-501/let-7a可能调控的靶基因;7.利用Western blot、RT-PCR以及荧光素酶报告基因实验验证miR-501/let-7a调控的靶基因;8.通过流式细胞术分析let-7a对肝癌细胞细胞周期的影响,Western blot检测let-7a转染的肝癌细胞系周期相关蛋白的表达;9.克隆HBV核心启动子以及增强子的不同截短体,荧光素酶报告基因实验检测let-7a对其调控作用;10.构建miR-501靶基因HBXIP的siRNA载体,和miR-501抑制剂共转染肝癌细胞系,分别检测HBVDNA、mRNA和蛋白水平的变化,探讨miR-501-HBXIP通路在HBV复制中的作用;11.构建Ras的负显性突变体,和let-7a抑制剂共转染肝癌细胞系,分别检测HBVDNA、mRNA和蛋白水平的变化,探讨let-7a-Ras通路在HBV复制中的作用。12.收集肝癌手术患者新鲜癌旁肝硬化组织,实时荧光定量PCR检测miR-501/let-7a在组织中的表达,分析miR-501/let-7a的表达和HBV复制状态之间的关系。【结果】1. 10个miRNAs在乙肝病毒稳定复制的肝癌细胞系HepG2.2.15和其亲本细胞HepG2中差异表达(>2倍),其中5个分子在HBV感染的HepG2.2.15细胞系上调,分别为hsa-miR-18a*,hsa-miR-431,hsa-miR-302b*,hsa-let-7a,hsa-miR-501;5个分子表达下调,分别为hsa-miR-148a,hsa-miR-320,hsa-miR-503,hsa-miR-519e*,hsa-miR-448;2. Real-Time RT-PCR结果显示:hsa-miR-18a*,hsa-miR-431,hsa-let-7a,hsa-miR-501在HepG2.2.15细胞系表达上调,hsa-miR-148a,hsa-miR-320,hsa-miR-503,hsa-miR-519e*,hsa-miR-448在HepG2.2.15细胞系表达下调,与芯片结果一致;3.适时荧光定量PCR实验结果显示,miR-501,let-7a的抑制剂显著抑制HBV DNA的水平,而miR-503,miR-519e*,miR-448以及miR-320的前体分子对乙肝病毒DNA水平没有影响,进一步适时荧光定量PCR和ELISA的结果表明miR-501,let-7a的抑制剂能显著抑制乙肝病毒mRNA和蛋白水平,并且具有时间依赖性;4.生长曲线实验表明,let-7a的抑制剂能促进肝癌细胞体外增殖能力,而miR-501的抑制剂则对肝癌细胞的增殖能力没有影响,因为,我们认为miR-501,let-7a能促进乙肝病毒的体外复制;5.生物信息学预测的众多miR-501的靶基因中包括已明确的乙肝病毒复制抑制分子HBXIP,而let-7a的预测靶基因中包括乙肝病毒mRNA序列和已明确的乙肝病毒复制相关分子Ras;6.与对照细胞相比,转染miR-501特异性抑制剂的HepG2.2.15细胞的HBXIP蛋白水平明显降低,而mRNA水平则无显著差异。miR-501通过结合克隆于荧光素酶基因编码区下游的HBXIP 3’UTR的靶位点,抑制荧光素酶表达;7. HBXIP siRNA能有效抑制HBXIP蛋白的表达,并能逆转miR-501的抑制剂对乙肝病毒复制的抑制效果; 8.根据计算机预测,let-7a可能直接作用于乙肝病毒mRNA序列,将let-7a的潜在作用靶点克隆入报告基因载体,双荧光素报告基因结果表明,let-7a不能直接作用于乙肝病毒mRNA序列。与对照细胞相比,转染let-7a反义抑制物的HepG2细胞的K-Ras蛋白水平明显升高,而mRNA水平则无显著差异。let-7a通过结合克隆于荧光素酶基因编码区下游的K-Ras 3’UTR的靶位点,抑制荧光素酶表达;9.流式细胞术检测周期发现,let-7a抑制剂促进肝癌细胞G1-S期进展,Western blot结果发现,CDK6, CCNJ等周期相关蛋白受let-7a负性调控;10. let-7a的抑制剂有效抑制乙肝病毒核心启动子和增强子的活性,发挥类似Ras通路的功能,负显性突变的Ras能逆转let-7a的抑制剂对乙肝病毒复制的抑制作用。11新鲜临床标本检测let-7a和miR-501的结果表明:let-7a和miR-501在乙肝病毒高复制的临床标本肝硬化组织明显高于乙肝病毒低复制的临床标本。【结论】1. miRNA在乙肝病毒稳定复制的肝癌细胞系和其亲本细胞中差异表达,可能参与乙肝病毒的复制;2. miR-501能促进乙肝病毒的体外复制,miR-501在临床标本中的表达和HBV复制状态呈正相关,其可能的分子机制是:miR-501负性调控靶基因HBXIP的表达而促进HBV的复制;3. let-7a能促进乙肝病毒的体外复制,let-7a在临床标本中的表达和HBV复制状态呈正相关,let-7a并不能通过直接作用于HBVmRNA而影响病毒复制,可能通过两条通路促进病毒复制:一是负性调控周期相关蛋白,使肝癌细胞处于静止期,病毒复制增强;二是抑制Ras蛋白及其下游通路,间接通过HBVmRNA的核心启动子和增强子而促进病毒复制。