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莱茵衣藻是绿藻产氢研究的主要材料,属低等真核植物,在有氧光照条件下,能够进行正常的光合作用释放氧气,但在无氧等胁迫条件下,能够转换代谢机制,诱导氢酶表达并催化产H<,2>.绿藻光合生物制氢为氢能源的开发提供了方便快捷的途径,在发达国家极受重视.氢酶是绿藻光合产氢途径的关键,而基因工程技术有望改善绿藻氢酶的性能,提高绿藻产氢量,成为绿藻生物制氢技术研究的热点之一.本研究选自莱茵衣藻(C.reinhardtii SE)为材料,在利用抗生素建立莱茵衣藻细胞无菌化培养的基础上,对细胞无氧诱导后,使用TRIzol试剂法提取C.reinhardtii SE的Total RNA,反转录PCR(RT-PCR)方法获得了其中编码氢酶HydA2的基因hydA2cDNA.同时,将氯化苄法试用于C.reinhardtii SE基因组DNA的提取,优化的提取条件是提取液pH9.0、氯化苄用量300μL、保温时间60min.以提取的基因组DNA为模板,PCR方法获得了编码HydA2的基因hydA2 DNA.C.reinhardtii SE hydA2 cDNA和C.reinhardtii SE hydA2 DNA分别连接于pMD18-T克隆载体,热转化E.coli JM109感受念细胞,分别筛选并获得了二者的阳性克隆.序列分析显示,本实验克隆出的C reinhardtii SE hydA2 cDNA由1518个核苷酸组成,与NREL(国际可再生能源实验室)报道的C.reinhardtii 21gr hydA2 cDNA同源性为98.2％;C.reinhardtii SE hydA2 DNA由3584个核苷酸组成,与NREL报道的C.reinhardtii CC-425 hydA2 DNA同源性为95％,含有10个外显子和9个内含子,二藻每段外显子的同源性均在95％以上;但内含子差异较大,长度相差380bp,且具有不同的同源性,第一和第二内含子同源性分别只有53.8％和40.5％.C.reinhardtii SE hydA2基因编码的氢酶蛋白HydA2,由505个氨基酸组成,理论分子量为53.69kD,理论等电点为pi6.15,序列中含有氢酶活性中心的4个保守片段.C.reinhardtii SE hydA2 cDNA和DNA已登录Genbank,登录号分别为AY436606和AY436607.