论文部分内容阅读
乙基香兰素是一种重要的广谱型香料，广泛应用于食品、饮料、日用品等工业，也是重要的医药中间体。它具有强烈的香子兰气味，香气强度为同量香兰素的3.5倍，在食品、饮料、酒类等行业中，添加量不到香兰素的三分之一，是取代香兰素的理想添加剂。目前，乙基香兰素的天然来源尚无报道，市售产品均由化学法合成。但工业上应用的诸种化学合成方法均存在一定的局限性，与化学法相比，生物催化法具备反应条件温和、产品安全性高和环境友好等优势。因此，本研究提出一条生物催化法合成乙基香兰素的新途径。首先以乙醛酸和邻乙氧基苯酚为原料合成3-乙氧基-4-羟基苯乙醇酸（EMA），作为制备乙基香兰素的前体物质。确定最佳工艺条件：反应温度50°C，反应时间5h，氢氧化钠浓度2mol/L，n乙醛酸:n邻乙氧基苯酚:nNaOH=1:1.2:2.5，乙醛酸与NaOH溶液共同滴加，四甲基溴化铵作催化剂，EMA最终得率可达87.2%。用沉淀法分离，精制后EMA纯度可达99%以上。利用质谱（MS）、傅立叶红外光谱（FT-IR）和核磁共振（NMR）对产物进行结构表征。扁桃酸消旋酶、扁桃酸脱氢酶和苯乙酮酸脱羧酶是扁桃酸代谢的关键酶。研究表达关键酶的菌株对底物的催化能力，结果表明E. coli/pET30a-mdlB表达的扁桃酸脱氢酶催化(S)-EMA制备得到3-乙氧基-4-羟基苯乙酮酸（EBF），Pseudomonas putida ATCC12633（P. putida）表达的苯乙酮酸脱羧酶催化EBF制备得到了目标产物乙基香兰素，但扁桃酸消旋酶对(R)-EMA不起催化作用。此外，乙基香兰素易被P. putida表达的苯甲醛脱氢酶氧化，得到副产物3-乙氧基-4-羟基苯甲酸（EBA）。为了切断P. putida对乙基香兰素的后续代谢，以P. putida基因组为模板，利用PCR技术扩增得到苯乙酮酸脱羧酶的基因mdlC，连接到表达载体pET28a(+)上并转化于宿主细胞E. coli BL21(DE3)。结果表明E. coli/pET28a-mdlC在IPTG的诱导下，表达了具有活性的苯乙酮酸脱羧酶。比较两步法和混合细胞催化制备乙基香兰素的研究，两种方法得到的乙基香兰素的含量相同，其中混合细胞催化法所需的反应时间为两步法的一半。以混合静息细胞为催化剂，确立最佳反应条件：pH7.0，反应温度37°C，混合细胞浓度3.0g DCW/L（干计），细胞浓度比为3:1，底物浓度10g/L，反应时间10h，乙基香兰素浓度3.9g/L。对混合细胞进行回收利用4次后，乙基香兰素得率仍维持在40%以上。液液萃取法分离乙基香兰素，确定最佳萃取条件：萃取剂乙酸乙酯，反应体系pH6.0，萃取溶剂比0.5:1，萃取3次后萃取率可达100%，精制后纯度可达99%以上。利用硅胶柱层析分离得到中间产物EBF和副产物EBA，其中，洗脱剂为正己烷/乙酸乙酯/甲酸（3:4:0.1，v:v:v）。并利用FT-IR和NMR分别对乙基香兰素、EBF和EBA进行结构表征。