基于核酸适体的生物传感技术检测结核分枝杆菌CFP10的研究

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目的:通过体外表达并纯化结核分枝杆菌重组培养滤液蛋白10(CFP10)以及筛选鉴定CFP10核酸适体,建立基于CFP10核酸适体的金纳米颗粒(AuNPs)生物传感器和AuNPs模拟酶可视化生物传感器检测血清中的CFP10辅助结核病诊断,为结核病诊断提供参考。方法:通过诱导含重组表达质粒pQE30-cfp10的BL21菌株表达CFP10,金属螯合层析进行纯化,Western blot鉴定其反应原性,BCA法测定纯化CFP10的浓度。依据文献报道筛选高亲和力的CFP10核酸适体,委托生物公司合成,采用生物素-亲和素-HRP系统验证核酸适体与CFP10的结合能力。柠檬酸三钠加热还原法制备AuNPs胶体溶液,根据高盐环境下核酸适体对AuNPs具有保护作用这一特性,建立基于CFP10核酸适体的AuNPs生物传感器检测CFP10。TMB显色法验证AuNPs的类过氧化物酶催化活性;核酸适体修饰巯基(-SH)后与AuNPs结合,制备AuNPs标记的核酸适体。包被CFP10多克隆抗体的微孔板捕获血清中的CFP10,再与AuNPs标记的核酸适体结合形成多克隆抗体-CFP10-核酸适体-AuNPs复合物;通过免疫反应特异识别目标抗原来调节AuNPs模拟酶的催化能力,进而调控AuNPs催化分解过氧化氢及过氧化氢与氯金酸、柠檬酸三钠反应生成金纳米粒子这对竞争反应,放大检测信号而测定CFP10,构建检测CFP10的模拟酶可视化生物传感器。检测结核病患者、体检健康者和肺病患者血清,评价两种方法辅助结核病诊断的效能。结果:表达纯化获得CFP10,BCA法测定其浓度为530μg/mL,Western blot证明其具有良好的反应原性。基于CFP10核酸适体的AuNPs生物传感器检测CFP10的灵敏度为61.9%,特异度为87.8%,阳性预测值为83.9%,阴性预测值为69.2%及诊断效率为74.7%。基于CFP10核酸适体的AuNPs模拟酶可视化生物传感器检测CFP10的灵敏度为78.9%,特异度为89.7%,阳性预测值为90.9%,阴性预测值为76.5%及诊断效率为83.6%。结论:表达纯化获取的CFP10具有良好的反应原性;采用柠檬酸三钠加热还原法制备的AuNPs胶体溶液分散良好并具备过氧化物酶活性;基于CFP10核酸适体的AuNPs生物传感器和AuNPs模拟酶可视化生物传感器具有辅助结核病诊断的潜力。
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