杨树是世界范围内具有重要的经济和生态价值的树种之一,也是林木遗传的模式树种。由落叶松-杨栅锈菌（Melampsora larici-populina）引起的叶锈病是杨树苗期和幼树阶段的重要叶部病害,常造成杨树生产上很大的损失。microRNA（miRNA）是一类长20²5 nt的小分子单链非编码RNA,植物中的miRNA主要通过miRNA与序列互补来切割靶mRNA,从而介导靶mRNA的降解以抑制靶基因的表达,进而参与植物生长发育与逆境胁迫响应。研究miRNA有助于揭示很多生命现象的分子机理,并有助于作物和林木的遗传改良。本论文通过对前期miRNA高通量测序中预测出的与抗锈病相关的两个novel miRNAs进行检测,并对其靶基因进行切割验证、全长扩增以及基因功能预测,构建miRNA前体基因的过表达载体,以便通过根癌农杆菌介导法转入杨树体内,从而深入了解杨树受病原菌侵染时miRNA的功能。具体研究结果如下:1.受落叶松-杨栅锈菌侵染的川杨novel miRNAs检测实验室前期构建了非亲和与亲和性杨树-栅锈菌互作条件下的杨树sRNA文库,本试验从高通量测序得到novel miRNAs中,挑选了novel_mir₁1和novel_mir₃57进行检测,通过stem-loop法设计茎环引物,检测到了和目标大小相一致的DNA条带,由此证实了川杨中novel_mir₁1和novel_mir₃57的存在。2.川杨novel miRNA靶基因验证用RLM-5’RACE验证novel_mir₁1和novel_mir₃57靶基因及切割位点,分别从novel_mir₁1预测的靶基因中挑选了两个（Potri.014G009300.1和Potri.014G00200 0.1）、novel_mir₃57预测的靶基因中挑选了三个（Potri.T044800.1、Potri.T02580 0.1和Potri.018G135600.1）进行验证。发现novel_mir₁1和novel_mir₃57与各自对应的靶基因的互补程度很高,且均对靶基因产生了切割。同时发现这些切割位点的位置并不是单一的,有的位于miRNA与靶基因的互补区域内,有的则位于互补区域以外,但大多数miRNA在互补区域内进行切割。3.靶基因全长扩增、分析及novel miRNAs对靶基因的调控从经过验证的靶基因中分别选取了novel_mir₁1和novel_mir₃57的一个靶基因进行全长扩增和生物信息学分析。得到novel_mir₁1的靶基因全长3899 bp,编码942个氨基酸,包含2829 bp的开放阅读框;novel_mir₃57的靶基因全长6010 bp,编码621个氨基酸,包含1866 bp的开放阅读框。对靶基因的预测蛋白进行保守结构域分析,发现两条序列都具有抗病基因特征的典型的NB-ARC和LRR结构域,将novel_mir₁1和novel_mir₃57的靶基因分别命名为PsRPM1和PsRPS2/5。利用BLASTP对靶基因编码的蛋白质进行氨基酸序列比对,结果显示这两个靶基因编码蛋白序列与毛果杨的NBS-LRR类抗病蛋白相似性最高。因此,推测PsRPM1和PsRPS2/5是NBS-LRR类抗病蛋白基因。采用qRT-PCR技术,检测川杨在感染落叶松-杨栅锈菌不同菌系后,不同时段的novel_mir₁1和novel_mir₃57及其相应抗病靶基因的时间动态表达情况。结果表明,两个novel miRNA总体上负调控靶基因的表达,且在亲和互作和非亲和互作中均存在显著差异。4.pze-miR11表达载体的构建从川杨基因组中克隆包含novel_mir₁1的前体序列,将novel_mir₁1命名为pze-miR11。将其带有成熟体的前体序列与载体pBI121连接,成功构建了pre-pze-miR11的植物过表达载体,并通过冻融法成功转入根癌农杆菌GV3101中,为进一步通过杨树遗传转化验证pze-miR11对抗病性基因的调控奠定基础。