第一部分研究在肝细胞癌家族史患者与健康无肝细胞癌家族史志愿者血浆间microRNA表达谱的不同实验目的：探讨肝细胞癌家族史患者与健康无肝细胞癌家族史志愿者血浆间microRNA表达谱的不同。实验方法：1、从华中科技大学附属同济医院肝脏外科的既往就诊患者中,挑选患有肝细胞癌的患者,进行严格的筛查,从中选出直系亲属(如父母、兄弟姐妹和子女)也患有肝细胞癌的患者,利用复查或住院手术期间,告知其实验目的后,签署知情同意书后,采集他们的外周静脉血。血液样品采集后置入含有EDTA成分的抗凝试管中,隔绝空气于4℃低温贮存,在采集样本后1小时内,经过离心法提取上清血浆成分,马上贮存于-80℃的低温冰箱中。2、患者血浆样品与同时提取的无肝细胞癌家族史健康志愿者的血浆样品,存放于含有液氮的低温罐中,经飞机运送到上海博豪生物有限公司。使用最新的基于16.0数据库的microRNA芯片进行两组间筛查对比。由microRNA芯片所获得的的结果,经过与健康志愿者对比分析,选出在肝癌家族史患者血浆中变化一致的miRNAs,而且表达量变化超过20倍的几种miRNA。3、查阅大量文献,选择目前尚未在肝癌中报道过的miRNA进行进一步的研究。实验结果：1、共收集到肝细胞癌家族史患者3例,患者中都至少有一个直系亲属同时患有肝细胞癌,各提取外周静脉血5ml。经过高速离心后,提取上清黄色透明液体,每例标本均提取淡黄色血浆3ml左右,贮存于高温处理和去RNA酶处理的1.5mlEP管中,保存于-80℃。2、经过严格的三次实验比对,共检出46种差异表达的microRNA,其中三例标本表达变化趋势一致的共有27个。3、表达量变化超过20倍的共有14个,其中在肝细胞癌家族史患者血浆中表达升高的有12中,降低的有2中,而这14种miRNA均未在肝癌中报道过。第二部分在两组间血浆中表达差异明显的microRNA在其他肝癌患者血浆中的验证实验目的：通过RT-PCR法验证芯片结果,并且扩大样本,引入非肝细胞癌家族史病人的血液标本,从而验证芯片所获结果的实用和有效性。实验方法：1、选择在2012年11月到2013年4月因肝细胞需要行手术治疗的患者10例,术前告知患者实验目的,签署知情同意书后,采集外周静脉血样品5ml。同样的方式采集10例无乙型肝炎的肝血管瘤患者的外周静脉血5ml。血液样品采集后置入含有EDTA成分的抗凝试管中,隔绝空气于4℃C低温贮存,在采集样本后1小时内,经过离心法提取上清血浆成分,马上贮存于-80℃的低温冰箱中。2、使用ABI Ambion公司的mirVanaTM PARIS试剂盒,进过多步离心纯化,提出血浆样品中的全部miRNA后,以无RNA酶水溶解后置入经过高温高压及无RNA处理过的1.5mlEP管中,贮存于-80℃条件下。提取后的miRNA样品,使用Toyobo公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix试剂盒,加入Invitrogen公司定制的miRNA颈环引物,进行逆转录,获得所有miRNA的cDNA样品,贮存于-20℃冰箱中。3、上一步骤获得的cDNA样品,使用Invitrogen公司定制的miRNA上下游引物,同时使用Takara公司的One Step SYBR(?) PrimeScriptTM RT-PCR Kit试剂盒,于ABIStep-one RT-PCR机中,进行扩增,实时定量检测目的miRNA的表达。使用2-△△ct法对数据进行标准化,再利用T检验比较两组间表达量的的差异,最后得出的结果与芯片结果进行比对,以验证芯片结果的可靠性。实验结果：1、经过严格的筛选,术后肝癌组织经过病理检查,确诊为原发性肝细胞的患者的血液样本采集完毕,患者对实验均知情同意,签字同意。10例原发性肝细胞癌患者血液样本标号为1-10,同时,在此期间住院手术的肝血管瘤患者,确定无肝癌家族史及乙肝病史的10例患者也筛选完毕,同时采集血液样品。经过多步离心,使用高温高压灭菌和无RNA酶化处理过的试管、枪头处理样品,每个样品均获得3ml左右淡黄色半透明血浆样品,提取过程均在低温下进行。2、取适量血浆样品,经过多步离心、洗涤、纯化和溶解后,每400μL血浆样品获得浓度约1μg/μL的Total RNA样品30λl。贮存于高温高压灭菌和无RNA酶化处理过的EP管内,-80℃保存。获得的RNA样品,吸取1-2μL左右,使用Toyobo公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix反应体系,加入针对各类miRNA的颈环引物,使用PCR仪,进行逆转录反应,获得每个样本的cDNA样品10μL。由于miRNA的特殊性,第一部分实验筛查出的14种miRNA,必须分别加入特定的颈环引物,所以这20个患者共获得cDNA样品280个。贮存于-20℃下。3、上一步获得的cDNA样品,使用Invitrogen公司定制的miRNA上下游引物,同时使用Toyobo公司的SYBR(?)reen Realtime PCR Master Mix-Plus试剂盒,于ABIStep-one RT-PCR机中进行RT-PCR反应,所得数据记录在电脑中,经过内参标准化。每个样本的每一种miRNA样品的RT-PCR实验都重复三遍,每次都有两个附孔。使用2-△△ct法对数据进行标准化后,再与所获得的芯片结果进行比对,发现芯片结果得到验证,这10例原发性肝细胞癌患者组与10例肝血管瘤患者组的14种miRNA的表达量的变化都与芯片结果一直,但是表达量的差异程度略小于芯片结果。经过更大样本的验证,芯片所获得结果真实可靠,可以进行下一步实验。第三部分：miR-216b在原发性肝细胞癌患者的癌组织中的表达量与癌旁肝组织中的表达量的变化,并与血浆芯片结果进行比对,同时研究miR-216b的表达与患者临床病理参数和预后的相关性。实验目的：继续使用RT-PCR法对原发性肝细胞患者手术标本中的miRNA表达量进行检测,选出代表性的miRNA进行进一步研究。实验方法：1、对前几部分实验所获得的数据进行比对,从中选择出表达差异最为明显的miRNA进行组织中表达量的进一步验证。2、随机选取从2008.4-2013.4在本院住院手术的原发性肝细胞癌患者50例,术中标本按癌组织和癌旁肝组织进行取材,低温贮存于液氮中运输,分装后-80℃贮存。这50对标本,进行匀浆、离心等多部实验,提取出样品total RNA。3、查阅大量文献后,选取miRNA-216b进行下一步研究,上述步骤所取得的RNA样品,使用Toyobo公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix试剂盒,加入Invitrogen公司定制的miRNA-216b颈环引物,进行逆转录,获得的cDNA样品,贮存于-20℃冰箱中。获得的cDNA样品,使用Invitrogen公司定制的miRNA-216b上下游引物,同时使用Toyobo公司的SYBR(?)reen Realtime PCR Master Mix-Plus试剂盒,于MBI Step-one RT-PCR机中,进行扩增,实时定量检测miRNA-216b的表达。4、上述结果,使用2-△△ct法对数据进行标准化,再利用T检验比较癌组织与癌旁组织的表达量的差异。5、结合患者临床病理资料,比较不同病理分期、肿瘤大小、远处转移等临床病理因素对于miRNA-216b的表达的影响。6、对于上述患者进行随访,调查术后患者生存情况、复发情况,从而研究miRNA-216b的表达与患者术后预后的影响。实验结果：1、经过查阅大量文献,发现miR-216b从未在肝癌中被报导过。芯片结果也显示,它在肝细胞癌家族史患者血浆中的表达与无家族史健康志愿者血浆中的表达差异最为明显,降低约122倍。说明这可能是一个抑癌基因,所以挑选它作为继续研究的靶点。2、选取30-60之间的患者,于术中采集新鲜的肝癌及癌旁组织标本,贮存于-80℃。以trizol提取组织Total RNA样品,每个样品各获得RNA30μL,浓度约1μg/gL。立即进行下一步逆转录或冻存于-80℃冰箱中。3、4使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix试剂盒和miRNA-216b颈环引物,进行逆转录,每个样品共获得特殊的cDNA10μL,浓度约1μg/μL。再经过RT-PCR法,测量出miR-216b在癌旁与癌组织的表达量,再经过T检验,发现75%的原发性肝细胞癌患者的癌旁组织的miR-216b的表达量明显高于癌组织,而平均的表达量差异约为4.45倍,差异有统计学意义(p<0.05)。4、按照患者的miR-216b的癌组织中的表达量,和作为参照物的肝血管瘤患者正常肝组织标本中miR-216b的表达量对比,分为高表达组和低表达组。结合临床病理资料,发现miR-216b低表达组的肿瘤的明显大于高表达组,门脉癌栓也明显多于低表达组。两组构成比进行卡方检验,发现有统计学意义(p<0.05)。其余临床病理资料,两组间差异不明显。5、随访两组患者,发现miR-216b高表达组患者的术后五年总生存率和无瘤生存率分别是65%和57%,而miR-216b低表达组的术后五年总生存率和无瘤生存率分别是37%和28%。两组间差异明显,具有统计学意义(p<0.01)。第四部分：miR-216b对于肝癌细胞系HepG2细胞和SMMC7721细胞增殖和侵袭能力的影响实验目的：研究miR-216b对于肝癌细胞系HepG2细胞和SMMC7721细胞增殖和侵袭能力的影响实验方法：1、RT-PCR法检测肝细胞癌各细胞系中miR-216b的表达量,从中选择出表达量最高和最低的进行下一步实验。2、在lipo2000介导下,进行RNA干扰,以miR-216b mimics转染HepG2细胞,转染后使用RT-PCR法检测miR-216b的表达。类似的步骤,以miR-216b inhibitor转染SMCC-7721细胞,再用RT-PCR法检测miR-216b的表达。3、进行CCK-8实验,检测转染后的HepG2细胞和SMCC-7721细胞的增殖能力。4、进行软琼脂克隆形成实验,检测转染后的HepG2细胞和SMCC-7721细胞的非锚定增殖能力。5、进行划痕实验,检测转染后的HepG2细胞和SMCC-7721细胞的迁移能力。6、进行Transwell实验,检测转染后的HepG2细胞和SMCC-7721细胞的侵袭能力。7、HepG2细胞和SMCC-7721细胞分成两组,种植于裸鼠皮下,进行裸鼠皮下成瘤实验。其中HepG2细胞组给予miRNA mimics瘤内注射,SMCC-7721细胞给予miRNA inhibitor瘤内注射。注射期间测量肿瘤的体积,三周后测量肿瘤的重量,在体内试验中检测miR-216b的作用。实验结果：1、经过RT-PCR检测,miR-216b在肝癌细胞系中表达以HepG2细胞为最低,以SMCC-7721细胞表达量为最高,所以选择这两个细胞系进行下一步实验。2、转染mimics后,与对照组相比较,miR-216b在HepG2中的表达明显升高；转染inhibitor后,与对照组相比较,miR-216b在SMCC-7721中的表达明显降低。证明这两个RNA干扰试剂的有效性。3、经过mimics转染后,在7天内观察]HepG2细胞的增殖情况,第三天的时候,转染组与对照组比较,它的增殖明显受到增强,一直到第七天,增强程度逐渐增加,两组间差异有统计学意义(p<0.05)。经过inhibitor转染后,在7天内观察SMCC-7721细胞的增殖情况,第三天的时候,转染组与对照组比较,它的增殖明显受到抑制,一直到第七天,受抑制程度逐渐增加,两组间差异有统计学意义(p<0.05)。4、经过mimics转染后,在两周内观察HepG2细胞的非锚定增殖情况,两周后,转染组与对照组比较,它所形成的的克隆的个数和大小都明显大于对照组,两组间差异有统计学意义(p<0.05)。经过inhibitor转染后,在两周内观察SMCC-7721细胞的非锚定增殖情况,两周后,转染组与对照组比较,它所形成的的克隆的个数和大小都明显小于对照组,两组间差异有统计学意义(p<0.05)。5、经过mimics转染后,在48小时内观察HepG2细胞移动能力,转染组与对照组比较,它的划痕的愈合速度明显快于对照组,两组间差异有统计学意义(p<0.05)。经过inhibitor转染后,在48小时内观察SMCC-7721细胞的移动能力,转染组与对照组比较,它的划痕的愈合速度明显慢于对照组,两组间差异有统计学意义(p<0.05)。6、经过mimics转染后,在48小时内观察HepG2细胞通过matrigel的侵袭能力,转染组与对照组比较,它进入到下层小室的细胞数明显多于对照组,两组间差异有统计学意义(p<0.05)。经过inhibitor转染后,在48小时内观察SMCC-7721细胞通过matrigel的侵袭能力,转染组与对照组比较,它进入到下层小室的细胞数明显少于对照组,两组间差异有统计学意义(p<0.05)。7、裸鼠皮下移植瘤生长至21天,它的生长曲线发现,mimics组和inhibitor组的细胞形成的皮下瘤生长速度在21天后明显低于和高于各自的对照组(p<0.01)；第21天,mimics组肿瘤直径(2.40±0.41cm3)和inhibitor组肿瘤直径(1.60±0.21cm3)形成皮下瘤的平均体积与各自对照组肿瘤体积(1.19±0.29cm3)和(2.07±0.24cm3)相比明显减低(p<0,01)和增高(p<0.01); mimics组肿瘤重量(0.213±0.06)和inhibitor组肿瘤重量(0.170±0.04)形成皮下瘤的平均重量与各自对照组肿瘤重量(0.139士0.12)和(0.201±0.15)相比明显增高(p<0.01)和减低(p<0.01)。第五部分：miR-216b对于肝癌细胞系HepG2细胞和SMMC7721细胞增殖和侵袭能力的影响的机制研究实验目的：探讨miR-216b对于肝癌细胞系HepG2细胞和SMMC7721细胞增殖和侵袭能力的影响的机制。实验方法：1、因为miRNA主要作用于目的基因的3’UTR区域,从而影响该基因转录后的表达。使用miRbase等数据库和算法,预测miR-216b的作用靶基因。2、筛选出KRAS基因作为miR-216b的作用基因,预测miR-216b的结合位置和碱基序列。复制该基因3’UTR区域的全长序列,设计miRNA的作用序列的变异序列,作为对照组,进行luciferase实验,以确定miR-216b是否可与该序列特异性结合。分别使用mimics和inhibitor作用于该序列,观察结果。3、使用RT-PCR法和western blotting法检钡KRAS在转染mimics或inhibitor后的RNA表达水平和蛋白表达水平。4、使用RNA干扰技术,筛选出合适位点的KRAS基因的干扰基因,经过瞬转敲除KRAS的表达后,再加入miR-216b的mimics和inhibitor,观察敲除KRAS后对HepG2和SMCC-7721细胞增殖的影响。5、miR-216b敲除或者过表达后,研究KRAS的下游基因,进一步研究miR-216b的作用机理。实验结果：1、经过多个网上数据库和算法预测,其中五个数据库预测miR-216b可以作用在KRAS基因的3’UTR区,从而影响KRAS的蛋白表达,继而影响它的下游通路,影响肝癌细胞的增殖和转移。2、经过luciferase实验,发现miR-216b的mimics和inhibitor可以作用在KRAS基因的3’UTR区的特异位点,而该位点突变后,mimics和inhibitor对于3’UTR区的结合被抑制。3、使用miR-216b的mimics转染HepG2细胞,可以降低KRAS基因的蛋白表达量,与对照组见有明显差异,而对于KRAS的mRNA表达水平无明显影响,说明miR-216b是作用于KRAS的转录后过程。使用miR-216b的inhibitor转染SMCC-7721细胞,可以升高KRAS基因的蛋白表达量,与对照组见有明显差异,而对于KRAS的mRNA表达水平无明显影响,进一步说明miR-216b是作用于KRAS的转录后过程。4、敲除KRAS基因后,miR-216b的mimics和inhibitor对于HepG2细胞和SMCC-7721细胞的增殖的抑制和促进作用消失,与对照组的增殖无明显统计学差异。说明miR-216b发挥抑制肝癌细胞的增殖作用,主要靠KRAS发挥作用。5、使用miR-216b的mimics转染HepG2细胞,可以降低KRAS下游p-AKT和p-ERK的表达。使用miR-216b的inhibitor转染SMCC-7721细胞,可以升高KRAS下游的p-AKT和p-ERK的表达。从而说明miR-216b对于肝癌增殖和转移能力的产生影响的信号通路。统计学分析所有的实验所得的结果都要重复三次,前文所提到的所有数据均以均数±标准差的形式来表示,同时应用SPSS16.0软件进行统计学分析,各组组间差异采用t检验或单因素方差分析(ANOVA),而分类变量的比较一般采用卡方检验,使用Kaplan Meier去对生存率进行分析,认定p<0.05为差异有显著的统计学意义。结论1、miR-216b在原发性肝细胞癌家族史患者的血浆中的表达量明显低于健康志愿者。2、miR-216b在原发性肝细胞癌患者的癌组织中的表达明显低于癌旁肝脏组织中的表达。而且miR-216b在癌组织中的表达量高低与患者的肿瘤大小、门脉癌栓的有无以及术后的预后密切相关。3、抑制或者过表达miR-216b可以在体外细胞实验和裸鼠体内细胞成瘤实验中,影响肝癌细胞系的增殖。4、抑制或者过表达miR-216b可以在体外细胞实验中影响肝癌细胞系的运动和侵袭能力。5、miR-216b主要靠直接作用于KRAS基因,通过PI3K/ER和AKT通路发挥作用,从而抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。