HBV疫苗志愿接种者PBL中CD4+T、CD8+T细胞TCRβ链CDR3谱系中的监测及CDR3分子特征初步分析

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目的:  初步分析20例HBV(Hepatitis B virus,HBV)疫苗志愿接种者(布依族、侗族、苗族、汉族)接种前后外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)中CD4+T、CD8+T细胞受体(T cell receptor,TCR) beta链各家族互补决定区3(complementaritydetermining region3,CDR3)谱系的变化,并初步分析CD8+T细胞CDR3谱系和HLA-A、CD4+T细胞CDR3谱系和HLA-DR的关系;对部分HBV疫苗志愿接种者,出现的单或寡克隆性增生CD4+T、CD8+T细胞的家族CDR3区进行基因和氨基酸组成分析。  方法:  (1)抽取遵医2008级民族班中各志愿者外周血非抗凝血3ml,用电化学发光法筛选乙肝五项表面标记物阴性的20例布依族、侗族、汉族、苗族乙肝疫苗志愿者;  (2)在0,1,6月接种HBV疫苗,完成HBV疫苗的三次接种;  (3)并于接种前、接种第二针后14天、接种第三针后14天采集外周血样本(15ml/次);  (4)免疫磁珠法(Magnetic Activated Cell Sorting.MACS)分选各PBL样本中的CD4+T细胞、CD8+T细胞,流式细胞仪检测分选纯度;  (5)提取各样本CD4+T细胞、CD8+T细胞中的总RNA,逆转录合成cDNA,根据TCRβ链26个可变区基因家族设计相应的26条TRBV上游引物,在恒定区设计一条共用的TRBC下游引物,采用荧光定量PCR(fluorescence quantitative polymerase chainreaction,FQ-PCR)扩增26个TRBV家族包含完整CDR3区段的cDNA; FQ-PCR熔解曲线法分析HBV疫苗志愿接种者接种前、后CD4+T、CD8+T细胞TCRβ链的26个TRBV家族CDR3谱系漂移的特征;  (6)采集20例(布依族,侗族,苗族,汉族)HBV疫苗志愿接种者EDTAK2抗凝外周血5ml,提取基因组DNA,采用PCR-SBT(Sequencing based typing.SBT)法测序HLA-A、HLA-DR等位基因序列;  (7)选择部分HBV疫苗志愿者接种后CD8+T和CD4+T细胞谱型图上呈单峰的志愿者的TRBV家族PCR产物,在相同条件进行普通PCR后,1.5%琼脂糖凝胶电泳胶回收纯化,克隆测序,DNA tools6.0等生物信息学软件分析CDR3区的基因和氨基酸组成。  结果:  (1)20例HBV疫苗志愿接种者,完成全程接种后14天,HBV表面抗体检测全部大于10IU/L:  (2)20例HBV疫苗志愿接种者,在接种后CD4+T、CD8+T细胞的26个TRBV家族CDR3的熔解曲线谱系图中,多数家族和接种前比较无变化,但每个志愿者均出现一个或几个TRBV家族CDR3的优势利用;  (3)20例HBV疫苗志愿接种者接种前和接种后CD4+T和CD8+T细胞出现的优势利用TRBV家族并不相同;  (4) HLA位点相同的不同志愿接种者之间存在共同优势利用的家族;  (5)相同民族志愿者中,未找到显著优势利用的TRBV CDR3谱系;HLA相同的志愿者中,部分由多峰变为单峰的家族进行测序,未找到完全相同的CDR3序列。  结论:  (1)20例HBV疫苗志愿者在第三次HBV疫苗后HBS-Ab滴度均大于10IU/L,提示均产生免疫应答,无不应答现象产生;HBV疫苗志愿接种者接种前和接种后TCR CDR3谱系的变化,提示HBV疫苗接种诱导了机体相应的T细胞应答;  (2) CD4+T和CD8+T细胞出现的优势利用TRBV家族CDR3的多样性,提示: HBV抗原的多样性和个体之间不同的HLA分子造成了机体T细胞应答的多样化,同时T细胞对HBV的应答和HLA表现一定的相关性;  (3)4个民族之间及HLA表位相同的志愿者均未发现完全共同的TRBV家族和CDR3区,提示HBV疫苗接种后T细胞应答可能存在较多的交叉反应性。
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