论文部分内容阅读
木聚糖酶能够将半纤维素中木聚糖水解为单糖和寡糖,已广泛应用于多个领域。玉米的加工副产物玉米麸皮作为重要的饲料原料,木聚糖含量丰富,但结构极为复杂,难以被传统木聚糖酶降解。本研究以实验室保存的嗜酸黑曲霉Aspergillus niger MJ5和购买的八株镰刀菌为材料,用添加了玉米麸皮的盐离子培养基进行降解玉米麸皮木聚糖的产酶菌株筛选。以玉米麸皮木聚糖为底物通过对培养液上清进行酶活力测定,发现嗜酸黑曲霉A.niger MJ5和禾谷镰孢菌Fusarium graminearum 2697的培养液上清有较高的玉米麸皮木聚糖酶活性。根据基因组测序结果,从这两株菌中筛选到15个GH5和GH10家族的木聚糖酶基因,尝试克隆并在毕赤酵母中进行表达。从A.niger MJ5中克隆得到了11个可能的GH5和GH10家族木聚糖酶基因,GH10家族的木聚糖酶基因Anxyn10A在毕赤酵母中表达后检测到玉米麸皮木聚糖酶活性。重组AnXYN10A最适pH为5.0,最适温度为60°C,以小麦阿拉伯木聚糖为底物时其比活为2507 U/mg,Km和Vmax分别为5.67 mg/mL和2835μmol/min·mg,以自制玉米麸皮木聚糖为底物时其比活为22 U/mg,Km和Vmax分别为12.7 mg/mL,36μmol/min·mg。从F.graminearum 2697中克隆得到了4个可能的GH10家族木聚糖酶基因,Fgxyn10A和Fgxyn10B在毕赤酵母中表达后具有相对较高的玉米麸皮木聚糖酶活性,对两个重组酶进行了性质测定。FgXYN10A最适温度为50°C,最适pH为5.0,FgXYN10B最适温度60°C,最适pH为5.5,以小麦阿拉伯木聚糖为底物二者的比活分别为1105U/mg和451 U/mg,以自制玉米麸皮木聚糖为底物二者的比活分别为19 U/mg和14 U/mg。A.niger MJ5来源的木聚糖酶AnXYN10A降解玉米麸皮木聚糖的能力及综合性能优于F.graminearum 2697来源的木聚糖酶。为了进一步提高AnXYN10A的稳定性和催化活性,我们以AnXYN10A为材料进行突变研究,分别在G89位﹑I130位和Y177位﹑G210位引入二硫键,两个二硫键突变体最适pH和温度及比活均与野生型相当,在60°C处理10 min的热稳定性较野生型均有约5%的提升。通过序列及结构分析设计突变体T302Y﹑L24Y﹑R161A,它们的最适温度和pH均与野生型一致,其中突变体T302Y热稳定性大幅提升,60°C处理10 min还剩余80%的酶活,而野生型仅剩余55%的酶活,比活较野生型下降了19%。突变体L24Y比活较野生型提升12%,但热稳定性下降严重（60°C处理10 min失活,而野生型剩余55%的酶活）。突变体R161A的热稳定性与野生型相当,比活较野生型有11%的提高。我们将二硫键突变与T302Y﹑R161A进行组合获得了组合突变体AnXYN10A-M,在毕赤酵母中表达的AnXYN10A-M最适温度和pH与野生型一致,热稳定性较野生型有大幅提高,60°C处理30 min剩余67%的酶活（同一条件下野生型剩余约30%的酶活）,60°C的半衰期较野生型提高了3倍,Tm值提高了6.1°C。以小麦阿拉伯木聚糖为底物时比活为2251 U/mg,以玉米麸皮木聚糖为底物时比活为21 U/mg,与野生型相当。本研究通过对木聚糖酶基因资源的挖掘成功从A.niger MJ5和F.graminearum 2697中克隆了15个可能的木聚糖酶基因,并尝试在毕赤酵母当中进行了表达,获得了3个活性相对较高的玉米麸皮木聚糖降解酶。同时对AnXYN10A进行了突变研究,组合突变体AnXYN10A-M热稳定性大幅提升,催化活性与野生型相当,在饲料工业具有潜在的应用价值。