第一部分IL-10极化巨噬细胞的体外研究研究背景近几十年,巨噬细胞的功能得到进一步的认识。巨噬细胞起源于单核细胞祖细胞,是一种多潜能的细胞群体,能够根据不同的局部组织微环境分化为不同的表型。骨髓来源的单核细胞进入血液循环系统分配到身体的大部分脏器并在那里分化为成熟的巨噬细胞。在不同的脏器中以不同的名称命名为特殊的巨噬细胞亚型,例如肝脏中的枯否细胞、脑组织中的小神经胶质细胞、肺脏中的肺泡巨噬细胞、脾脏中的脾巨噬细胞、肠道中的肠巨噬细胞、腹腔中的腹膜巨噬细胞、脂肪组织中的巨噬细胞、动脉粥样硬化斑块中的泡沫细胞和骨组织中的破骨细胞。巨噬细胞在IL-10或转化生长因子(TGF-β)的刺激下会分化为2型巨噬细胞的2C亚型,其主要作用为抑制炎症反应促进组织的修复。M2型巨噬细胞参与许多自身免疫性疾病(AD)的治疗,例如：类风湿性关节炎(RA)、自发性脑脊髓炎(EAE)、特发性血小板减少性紫癫(ITP)、多发性硬化(MS)等。假体的无菌性松动是全关节置换的一个主要的远期并发症。在假体松动的过程中,巨噬细胞吞噬磨损颗粒和其它附属产物,产生促炎症细胞因子和趋化因子,进一步激活一种生物级联反应,是假体周围骨溶解的一个最重要的原因。磨损颗粒持续存在刺激周围组织细胞,这个过程与自身免疫性疾病有类似的地方。研究目的体外研究观察IL-10极化在磨损颗粒刺激骨髓来源的巨噬细胞中的作用：1.确定IL-10极化巨噬细胞的理想用量。2.观察IL-10对磨损颗粒刺激的骨髓来源的巨噬细胞的基因表达的影响。3.观察IL-10对磨损颗粒刺激的骨髓来源的巨噬细胞的蛋白表达的影响。实验材料和方法1.将RAW264.7细胞种入六孔板中(2×105个／孔),4-6小时后细胞贴壁,加入IL-10进行刺激,细胞分为三组：不加IL-10(对照组)；加入10μg IL-10;加入20μg IL-10。加入IL-10进行刺激后48小时收集细胞提取蛋白。Western blot方法检测STAT3和磷酸化STAT3的表达。2.原代骨髓起源的巨噬细胞的分离与培养CO2气体法处死Sprague Dawley大鼠,75%酒精中浸泡3次,每次10分钟。分离大鼠股骨和胫骨,用注射器和DMEM完全型培养基将骨髓细胞冲入50m1无菌离心管中,用细胞过滤器过滤细胞并离心,接着加入4摄氏度预冷的红细胞裂解液裂解30分钟,裂解红细胞完成后,用1xPBS清洗细胞2次,用70%DMEM完全培养基和30%L929细胞培养上清重悬细胞进行培养。过夜后将未贴壁的细胞丢弃。3.将骨髓起源的巨噬细胞种入12孔盘中(5x105个／孔),待细胞贴壁后,将其分为三组：第一组不加任何刺激(阴性对照组)；第二组加入2mg PMMA颗粒(阳性对照组)；第三组加入2mg PMMA颗粒和20ng IL-10(处理组)。细胞刺激5天后收集细胞提取总RNA进行基因表达检测。RT-PCR法检测IL-1β、CD80、MHCⅡ、CD163、IL-10、 TGF-β1和CCR2基因表达的变化。4.将5x103个细胞种入8孔chamber slide里,待细胞贴壁后,将细胞随机分为三组：第一组不加任何刺激(阴性对照组)；第二组加入2mg PMMA颗粒(阳性对照组)；第三组加入2mg PMMA颗粒和20ng IL-10(处理组)。刺激一周后进行细胞免疫化学染色,检测iNOS和CD163的表达情况。实验结果1. Western blot法检测RAW264.7细胞经过不同浓度IL-10刺激后总的STAT3口磷酸化的STAT3表达情况。从实验结果看,经过IL-10刺激的RAW264.7表达总的STAT3没有变化,但是磷酸化的STAT3的表达随着IL-10浓度的增加表达逐渐增强。2.实时定量RT-PCR方法检测经过PMMA颗粒或PMMA颗粒与IL-10共同刺激的骨髓起源的巨噬细胞中IL-1β、CD80、MHCⅡ、CD163、IL-10、 TGF-β1和CCR2基因表达的变化。实验数据表明PMMA颗粒刺激组能够诱导骨髓起源的巨噬细胞IL-1β、CD80和MHC Ⅱ的基因表达。经过IL-10处理的组能够减少PMMA颗粒刺激骨髓起源的巨噬细胞中IL-1β的基因表达(p<0.01)。而其他的M1标记物：CD80、MHCⅡ的基因表达没有明显的变化。同时,IL-10处理组能明显的增加骨髓起源的巨噬细胞中CD163、IL-10、 TGF-β1和CCR2的基因表达(p<0.01)。3.细胞免疫组织化学染色用于检测特异性M1标记物iNOS和M2标记物CD163的表达。细胞免疫组织化学染色显示PMMA颗粒能够显著诱导iNOS的表达(p<0.001)。IL-10处理组能明显抑制PMMA颗粒诱导iNOS表达的作用。IL-10处理组还可以明显促进骨髓起源的巨噬细胞表达CD163(p<0.001)。结论1.20ngIL-10是理想的实验研究用量。2.IL-10可以促进M2型巨噬细胞的基因表达。3.IL-10能够促进PMMA颗粒刺激的骨髓来源的巨噬细胞分化为M2型巨噬细胞并且减少PMMA颗粒刺激的骨髓来源的巨噬细胞的分化为Ml巨噬细胞。第二部分I L-10通过极化巨噬细胞减轻磨损颗粒诱导的骨溶解研究背景在中国每年有超过一百万的全关节置换病人经过15-25年的使用需要进行关节假体修复,这是由于在骨与内植物界面存在慢性的炎症。下肢的全髋或全膝关节置换是外科手术干预成功的范例,其成功率超过90%。无菌性假体松动是关节置换的一个棘手长期并发症,由于较高的关节翻修手术风险和较高的相关的医疗保障成本。随着外科技术、应用材料和假体设计水平的提高,颗粒产生明显减少了,但是磨损碎屑诱导的骨溶解仍然没有得到解决,仍然有必要改善关节假体的长期使用性能。近几十年来,许多研究者把重心转移于研究无菌性假体松动的具体机制。巨噬细胞吞噬磨损颗粒和其它附属产物,产生促炎症细胞因子和趋化因子,进一步激活一种生物级联反应,是假体周围骨溶解的一个最重要的原因。近期研究表明在假体松动的过程中M1型巨噬细胞占主导地位。当磨损颗粒或离子达到一定数量后会激活非特异性的免疫途径,局部包围假体的细胞会产生前炎症细胞因子和趋化因子,主要包括：IL-1β、IL-8、IL-12、TNF-α、IFN-γ, M-CSF、MCP-1和MIP-1α。当磨损颗粒激活生物级联反应后,成骨细胞表达RANKL明显增加。RANK/RANKL信号通路是在正常或病理情况下激活破骨细胞及下游分子中起到中心性决定作用。磨损颗粒可以激活破骨细胞,反之破骨细胞也可以吞噬磨损颗粒,并保持发挥骨吸收细胞的作用。磨损颗粒的产生刺激巨噬细胞使其产生前炎症因子,并激活破骨细胞造成骨溶解,骨溶解又加重磨损颗粒的产生,这个级联放大反应形成一个恶性循环。IL-10能够诱导巨噬细胞向M2型分化,抑制炎症反应。由于M2型巨噬细胞在自身免疫性疾病中起到明显的治疗作用,所以我们提出假设IL-I0通过极化巨噬细胞减轻磨损颗粒引起的骨溶解。研究目的1.建立模仿假体松动的air pouch动物模型。2.观察IL-10能否改善磨损颗粒引起的骨溶解。3.探讨IL-10减轻磨损颗粒引起的骨溶解的具体机制。实验材料和方法1.建立实验动物模型剔除Balb/c小鼠背部毛发露出背部部分,用碘伏消毒背部皮肤,用5毫升注射器皮下注射3毫升过滤过的无菌空气在皮下形成一个空气囊泡。每隔一天向空气囊泡中注射一次空气以维持空气囊泡形态。6天后,通过手术方法从供体小鼠得到一部分股骨(约0.5厘米)或一部分头盖骨(约0.6厘米x0.3厘米)并手术置入空气囊泡中。24小时后,所有小鼠分为三组(每组8只)：第一组只注射200μl PBS(阴性对照组)；第二组注射200μlUHMWPE颗粒(2毫克)(阳性对照组)；第三组注射200μl UHMWPE颗粒并且20ngIL-10溶解其中(处理组)。IL-10或PBS每隔一天补注射一次。2. Micro CT扫描在手术置入股骨或头盖骨24后和处死小鼠之前分别进行Micro CT扫描。扫描参数设置为:30μm isotropic voxel size;400 projections; 200 ms exposure time; 70 kW voltage and 114 μA current 。用Micro CT分析软件进行三维图像的重建和骨密度分析。用骨体积与总体积的比值分析总的骨质丢失情况。3.组织病理学检测从第一次注射IL-10开始开始记录,七天后处死所有实验小鼠,收集股骨或头盖骨及其周围完整的炎性反应膜。一部分炎性膜冻存于负80摄氏度低温冰箱中用于实时定量RT-PCR和western blot分析STAT1、NF-κBp65、JNK1、STAT3、SHIP、STAT6和PPAR-γ的基因或蛋白表达水平。头盖骨和炎性反应膜包埋于冰冻切片包埋液中冻存于负80摄氏度低温冰箱,制备冰冻切片,用于检测TRAP阳性细胞的数量。股骨和炎性反应膜用10%的福尔马林固定液固定,用10%EDTA溶液脱钙一周后制备石蜡切片。H&E染色用于观察不同组别之间的炎性反应膜的厚度以及细胞的浸润情况。免疫组织化学染色用于检测iNOS或CD163的表达情况。实验结果1.炎性反应膜的特征UHMWPE颗粒诱发了明显的局部炎症,导致与阴性对照组相比,其他两组炎性反应膜的厚度和细胞浸润数量的明显增加。阴性对照组的炎性反应膜的平均厚度为125.8±5.58μm,而阳性对照组的炎性反应膜的平均厚度为449.81±10.59μm(p<0.001)。同时细胞计数显示细胞浸润数量从4749±144个细胞／平方毫米(阴性对照组)增加到6564±144个细胞／平方毫米(阳性对照组)(p<0.001)。尽管在所有UHMWPE颗粒处理组中巨噬细胞的比例与阴性对照组相比明显增加,但是,IL-10处理组的细胞浸润数量明显减少(5674±139个细胞／平方毫米,p<0.001)。2.IL-10在M2型巨噬细胞极化和骨溶解中的作用包裹有股骨的炎性反应膜的组织学评估表明与阴性对照组相比其他两组炎性反应膜中iNOS阳性巨噬细胞和CD163阳性巨噬细胞明显增多(p<0.01)。然而与只有UHMWPE颗粒处理的阳性对照组相比IL-10处理组减弱了iNOS蛋白的表达(p<0.05),另一方面IL-10处理组明显增强了CD163蛋白的表达(p<0.05)。TRAP染色表明IL-10处理组的切片中TRAP阳性细胞的数量明显减少,而只有UHMWPE颗粒处理的切片表现为很强的TRAP活性(p<0.001)。Micro CT扫描显示IL-10能够明显的减轻UHMWPE颗粒诱导的骨溶解,骨密度(BMD)分析表明IL-10处理组的骨密度明显高于只有UHMWPE处理的阳性对照组(p<0.001),同时,骨体积与总体积的比值分析表明IL-10处理组的骨体积比例更高(p<0.001)。3.实时定量RT-PCR检测STAT1、 NF-κBp65、JNK1、STAT3、SHIP、STAT6和PPAR-γ的基因表达数据显示经过IL-10处理后不仅抑制了STAT1 (p<0.05)、NF-κBp65 (p<0.05)和JNK1(p<0.01)的基因表达,而且诱导了STAT3 (p<0.05)的基因表达。然而,STAT6、SHIP和PPAR-γ的基因表达没有明显的差异。4. Western blot检测信号通路蛋白IL-10处理组的样品与只有UHMWPE颗粒处理组样品相比表现为低表达磷酸化的STAT1和磷酸化的NF-κBp65。同时有趣的是IL-10除了增强磷酸化的STAT3蛋白表达外还可以增加总的STAT3的蛋白表达。实验结论1.IL-10能够减轻磨损颗粒诱导的骨溶解。2.IL-10能够极化巨噬细胞分化为M2型巨噬细胞。3.IL-10主要是通过抑制JAK/STAT1和NF-κB p65信号通路对的活性和增强JAK/STAT3信号通路的活性极化巨噬细胞。