背景 卵巢癌占妇科恶性肿瘤的三分之一，其中卵巢上皮癌占卵巢恶性肿瘤的85％～90％，5年存活率仅25％～30％，严重威胁妇女的生命。卵巢癌病因未明，早期缺乏明显症状，也没有特异的肿瘤标记物，因此难以早期发现。卵巢癌直接蔓延和腹腔种植的特性，使得手术难以彻底清除病灶，而化疗也只能指数杀灭癌细胞，无法防止复发和转移。因此，研究卵巢癌发生、复发和耐药的机制，从而有针对性地制定治疗策略显得尤为重要。肿瘤干细胞理论认为肿瘤细胞中可能有极少数具有无限自我更新潜能的细胞，它们在恶性肿瘤发生、复发和耐药中起主要作用。为重新思考卵巢癌的发病机制和制定新的治疗策略提供了依据。 目的 探讨人卵巢上皮癌肿瘤干细胞体外培养和分离纯化的方法，并对其干细胞的特性进行鉴定。为研究卵巢癌发病机理及治疗和预防奠定基础。 方法 一、人卵巢上皮癌细胞的体外培养 1、取卵巢上皮癌患者的卵巢癌原发灶、转移灶、囊内液及腹水，分别用直接培养法、机械消化培养法、胰酶消化培养法和胶原酶消化培养法体外培养。 2、取其中一株卵巢黏液性囊腺癌细胞连续培养并建系。 3、建系细胞的生物学特性的检测。 二、人卵巢上皮癌耐药株的诱导 1、检测细胞对顺铂和环磷酰胺的药物敏感性，选择适当的诱导药物和浓度。 2、诱导卵巢上皮癌耐药株。 3、比较耐药株与诱导前的母株间的差异。 三、人卵巢上皮癌肿瘤干细胞的分离纯化和鉴定 1、双层琼脂培养法分离纯化肿瘤干细胞。 2、肿瘤干细胞的干细胞特性的检测。 3、肿瘤干细胞的表面标记物的检测。 4、肿瘤干细胞的致瘤性的检测。 结果 一、人卵巢上皮癌细胞的体外培养 1、腹水和囊内液直接培养较实体瘤培养易成功。实体瘤培养以机械消化培养法细胞活力最好，但混杂细胞多。胰酶消化法细胞活力最差，混杂细胞多，但获得单细胞数较机械法多。胶原酶消化培养法获得细胞数最多，混杂细胞最少，细胞活力好，是实体瘤培养的最佳方法。 2、腹水来源的卵巢粘液性囊腺癌细胞目前传至第60代。细胞经反复液氮冻存和复苏，生长稳定。免疫组化呈CA125，CEA，CK,ER，PR，PCNA阳性，MC(间皮细胞抗原)阴性。与手术切除癌灶组织免疫组化结果一致。 二、人卵巢上皮癌耐药株的诱导 1、经梯度浓度顺铂或环磷酰胺处理后，克隆形成率随药物浓度增高而下降。 顺铂较环磷酰胺有较强的抑制能力。 2、取腹水来源的稳定传至30代的卵巢癌细胞用环磷酰胺诱导耐药株成功。已稳定传至20代。检测其克隆形成率和耐药蛋白表达均高于诱导前。 三、人卵巢上皮癌肿瘤干细胞的分离纯化和鉴定 1、双层琼脂培养21天后，倒置相差显微镜下观察，见散在球形细胞克隆，克隆细胞呈致密细胞团，计数集落形成率OVA0.5％，OVA/CTX0.9％，HO-89100.4％。 2、细胞克隆的分离培养证实，肿瘤干细胞克隆具有不断地增殖和自我复制的能力。再克隆实验证明，克隆细胞在增殖的过程中会分化成克隆形成细胞和非克隆形成细胞。另外，细胞克隆移植入裸鼠皮下，能形成与原发瘤一致的肿瘤，也证实了克隆形成细胞具有多向分化的能力，能分化成卵巢癌中各种细胞。 3、免疫荧光染色证实肿瘤干细胞克隆表达乳腺癌耐药蛋白ABCG2。 4、流式细胞检测OVA，OVA/CTX和HO8910细胞，ABCG2阳性细胞数，OVA中占0.4％,OVA/CTX中占5.5％,HO-8910中占0.5％。 5、裸鼠移植试验还证实了克隆形成细胞的致瘤性较未分离的肿瘤细胞强1000倍以上。 结论 1、胶原酶消化培养法获得细胞数最多，混杂细胞最少，细胞活力好，是实体瘤培养的最佳方法。 2、选取杀伤力较温和的环磷酰胺作诱导物，采用持续给药方式，能成功诱导出卵巢癌耐药株。 3、人卵巢上皮癌细胞中存在肿瘤干细胞样细胞亚群，这些细胞能在软琼脂上形成耐药的细胞克隆。它们具有不断地增殖和自我复制的能力及多向分化的能力，能分化成卵巢癌中各种细胞。而且致瘤性较未分离的肿瘤细胞强1000倍以上。 4、免疫荧光实验的结果证实克隆细胞表达ABCG2。目前研究表明，ABCG2是白血病，乳腺癌和脑瘤等肿瘤干细胞共同表达的表面标记物。流式细胞仪检测卵巢癌细胞中，ABCG2阳性细胞占0.4％-0.5％，与克隆形成率相近。但耐药株OVA/CTX中ABCG2阳性细胞占5.5％，较母株OVA明显增高。证明这些表达ABCG2的细胞与肿瘤的耐药性相关。