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目的:前期研究证明PZQ衍生物P96及DW-3-15具有显著的抗日本血吸虫成虫及童虫效应,本实验体外观察P96及DW-3-15对日本血吸虫PZQ抗性虫体的生物学效应,探讨P96及DW-3-15作为抗日本血吸虫候选新药的潜在价值。方法:单性日本血吸虫尾蚴(70±5条)感染小鼠,21天后,用半数有效致死剂量(ED50,25.98 mg/kg)PZQ对小鼠进行灌胃给药,每天一次,连续30天,停药21天后,再给予小鼠治疗剂量(200 mg/kg)PZQ,连续5天。停药2周后肝门静脉灌注收集虫体,置DMEM培养液中培养,分别加入不同浓度PZQ、P96和DW-3-15,作用16 h(过夜)后换新鲜培养液,继续培养72 h,每24 h体视显微镜下观察、记录一次虫体活力和形态变化,评价诱导虫体对药物的敏感性。结果:PZQ、P96和DW-3-15体外抗未诱导日本血吸虫成虫的临界致死浓度(虫体经药物作用后72 h活力降低率达90%的最低浓度)分别为14μmol/L、25μmol/L和45μmol/L。诱导虫体对PZQ的敏感性显著降低,临界致死浓度是抗未诱导虫体的8倍(112μmol/L);而对P96的敏感性有一定的下降,临界致死浓度是抗未诱导虫体的4倍(100μmol/L);对DW-3-15的敏感性与未诱导虫体相比则没有明显差异,临界致死浓度仍为45μmol/L。结论:经PZQ持续压力诱导的日本血吸虫对PZQ具有明显抗性,与P96及DW-3-15相比存在显著性差异(P<0.05),特别是对DW-3-15完全没有交叉抗性;提示PZQ衍生物P96及DW-3-15抗日本血吸虫的作用靶点与PZQ可能有一定差异,其作用机制可能不同,具有作为抗日本血吸虫候选新药的潜在价值,值得进一步研究。目的:通过观察Ahnak抗体拮抗PZQ体外抗日本血吸虫成虫生物学效应,探讨Ahnak蛋白是否是PZQ作用的重要靶分子。方法:肝门静脉灌注法收集感染小鼠体内的日本血吸虫成虫,进行体外培养,加入不同浓度(0.3、0.6、1.2、1.8、2.4μg/ml)Ahnak抗体,预孵育不同时间(0、1、2、4 h)后,再加入PZQ,作用16 h(过夜)后换液,继续培养72h,每隔24h置体视显微镜下观察、记录一次虫体存活数量和活力分值。结果:Ahnak抗体预孵育1 h,浓度为1.2μg/ml和1.8μg/ml时,对PZQ有明显拮抗作用,虫体72 h存活率均高达80%,活力降低率分别为71.1%和64.4%,与PZQ对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),其它浓度(0.3、0.6、2.4μg/ml)抗体对PZQ均无拮抗作用;抗体浓度为1.2μg/ml,预孵育时间为1 h,对PZQ有明显拮抗作用,其它预孵育时间(0、2、4 h),抗体对PZQ均无明显拮抗作用。结论:Ahnak抗体对PZQ的体外抗日本血吸虫成虫效应有一定的拮抗作用,Ahnak抗体预孵育1 h,浓度为1.2μg/ml是对PZQ的最佳拮抗方案,本研究结果为“钙通道—PZQ抗血吸虫效应靶点”假说提供了新的实验依据,Ahnak蛋白在日本血吸虫中的作用值得进一步研究。目的:利用蛋白质组学的方法和技术分离、鉴定PZQ抗性虫体与未诱导虫体之间的差异蛋白质,探讨PZQ抗血吸虫效应机制及潜在靶点。方法:应用PZQ抗日本血吸虫ED50和治疗剂量,使感染小鼠体内的虫体在持续药物压力下产生一定的抗药性,收集抗性虫体和未诱导虫体,提取总蛋白,采用双向凝胶电泳(2D-PAGE)和液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术筛选、鉴定两种虫体的差异表达蛋白质。结果:经筛选、鉴定,PZQ抗性虫体共有40种差异表达蛋白质,其中有31种蛋白质表达上调,6种蛋白质表达下调,另有3种蛋白质变化趋势无法确定。表达上调的蛋白质中有3种为两种虫体共有,有28种只在PZQ抗性虫体蛋白质双向凝胶上筛选得到。这些蛋白分别归类于细胞结构及运动相关蛋白(9种)、应激反应相关蛋白(4种)、参与虫体代谢的酶类(7种)、蛋白质翻译和结构调节蛋白(5种)、离子调节蛋白(3种)和一些功能未知蛋白(12种)。结论:PZQ持续压力下可使日本血吸虫蛋白质水平发生明显改变,提示PZQ持续压力可能促进或抑制了虫体特定基因的表达,差异表达蛋白可能与药物作用靶点有关。目的:通过测定日本血吸虫PZQ抗性虫体与未诱导虫体m RNA相对表达量,分析两者在转录水平的差异,并结合蛋白质水平的差异进行综合分析,为探索PZQ抗虫机理、虫体抗药机制,研发新药和疫苗,建立实验基础。方法:收集PZQ抗性虫体和未诱导虫体,使用TRIzol法分别抽提两种虫体的总m RNA,逆转录得到c DNA。根据差异蛋白质登录号在NCBI上搜索对应基因序列,设计引物,采用实时荧光定量PCR技术对c DNA进行相对定量,进而分析两种虫体的转录水平差异。结果:PZQ抗性虫体中核糖体蛋白/大亚基和钙调节蛋白基因的m RNA相对表达量较未诱导虫体均下降,组蛋白H2A和热休克蛋白70基因的m RNA相对表达量升高,差异均具有显著性统计学意义(P<0.01);而珠蛋白-3、磷酸丙糖异构酶、真核翻译延长因子1α2和肌球蛋白等基因的m RNA相对表达量与未诱导虫体无明显差异(P>0.05)。所检测的8种基因中有7种在转录水平和蛋白质水平的差异变化存在不一致性,只有组蛋白H2A基因的转录水平和蛋白质水平的差异变化一致,均表达上调。结论:经PZQ压力诱导的日本血吸虫抗药性虫体可发生转录水平的改变,且在转录水平和蛋白质水平发生的变化不完全一致。