论文部分内容阅读
精氨酸脱亚胺酶(arginine deiminase,简称ADI)途径每分解一分子精氨酸可产生一分子ATP,是一些微生物的主要能量来源。ADI催化该途径中的第一步反应,即将精氨酸降解为瓜氨酸和氨气。对于人类而言精氨酸属于非必需氨基酸,正常的细胞核组织可通过瓜氨酸在精氨酸-琥珀酸(ASS)合成酶下作用下合成,而一些人类癌细胞不表达ASS,从而不能从瓜氨酸合成精氨酸。因此,精氨酸脱亚胺酶有可能从根本上消灭或控制精氨酸缺陷型肿瘤,如黑色素癌和肝癌等。以往在ADI的制备中,多采用的是支原体(Mycoplasma arginini),在生物安全性方面存在一定的隐患。采用本实验室自行筛选的假单胞菌(Pseudomonas)制备ADI,使用优化后培养基,葡萄糖10 g/L,酵母膏5 g/L,蛋白胨4 g/L,精氨酸盐酸盐8 g/L,初始pH 7.0,接种量4%,装液量60/250 mL摇瓶,转速190 rpm,培养温度30℃,24 h后单位发酵液酶活由优化前的1.34 U/mL提高到1.82 U/mL,提高35%;在5 L发酵罐扩大培养中,酶活上升至2.17 U/mL,提高57%,达到了良好的产酶效果。经过硫酸铵盐析、透析、DEAE Sephadex A-50离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等一系列手段纯化ADI,纯化后的蛋白样品经SDS-PAGE证实为单一条带,分子量约为54 kDa。最终ADI酶活得率为5.8%,提纯倍数为11.0,比酶活为5.28 U/mg。初步验证了ADI的体内和体外的抗癌活性。ADI粗酶在体外对HepG2的抑制率在0.5 U/mL时达93.4%;纯化后ADI对肝癌细胞HepG2的抑制率在0.03 U/mL时达23.4%;ADI粗酶在两周合计给药5 U组别中,对肝癌细胞H22细胞的抑制率达到82.3%,对免疫器官的伤害最小。以上三部分实验均显示了ADI作为有效的抗癌药物的潜力。