枯草芽孢杆菌具有安全性高和分泌性能好的优点,成为继大肠杆菌后脂肪酶表达领域又一重要的原核表达体系,可作为食品行业脂肪酶表达的宿主。本文所表达脂肪酶LipS(基因序列信息见附录Ⅰ)是一种耐溶剂脂肪酶,可在有机相体系中高选择性地拆分制备l-薄荷醇,具有重要的工业应用价值。不同结构信号肽的分泌性能,基因的转录水平和翻译水平高低是影响脂肪酶表达和分泌的重要因素,本文对上述因素进行了考察优化,显著提升脂肪酶LipS的分泌表达量。含有脂肪酶自身信号肽的重组菌WB800(pMAlipSL),总转酯活力为40.23 U/L,胞外活力为4.22U/L,分泌效果较差。因此,本文首先依据信号肽结构的不同,对脂肪酶LipS合适的信号肽进行筛选,分别对Sec途径中6种不同疏水段长度的信号肽和Tat途径中研究较多的2种信号肽进行了筛选。结果显示,Tat途径中phoD信号肽的分泌效果最优,分泌效率达到24.29%,胞外转酯活力为9.82U/L,而Sec途径中则是NprB信号肽分泌效果最好,分泌效率达到19.26%,胞外活力为7.68 U/L。在此基础上,分别对phoD信号肽和NprB信号肽进行突变改造,进一步提升了它们的分泌效果,其中phoD信号肽突变体phoDDFR效果最好,分泌效率达到31.70%,胞外转酯活力为12.57 U/L。以不同复制子质粒pMA5和pHT43为骨架,构建了包括载体自身启动子在内的多种含不同启动子的表达载体,依次考察了组成型启动子P43和PHpaⅡ诱导型启动子PsacB和Pgrac,及杂合双启动子P43-Pgrac对脂肪酶LipS表达量的影响。其中含有诱导型启动子Pgrac的重组体系效果最好,在37℃条件下,诱导20h后,总活力达到60.97 U/L,较优化前提升了53.77%。随后对重组载体pHBphoDDFRL转录产物mRNA中SD序列与起始密码子AUG之间的序列进行突变改造,增加了前段mRNA的结构柔性,提升翻译表达速率,进而提高脂肪酶LipS总表达量。其中含突变体mRNARc的重组菌提升效果最显著,总活力提升了52.78%,达到93.15 U/L。在此基础上对重组菌诱导表达条件进行了一定优化,总活力达到127.80U/L。其中胞外酶活达到91.17 U/L,较含自身信号肽重组体系胞外活力提升20.6倍。