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目的:蛋白酶激活受体-2(Proteinase-actived receptors 2,PAR-2)是一种细胞膜表面受体,属于与G蛋白相耦联的蛋白酶激活受体超家族成员,广泛分布于各个系统和组织中,可被胰蛋白酶等丝氨酸蛋白酶激活。大量研究表明,PAR-2在多种消化系统肿瘤及其微环境中都有表达,且强度高于正常组织细胞,与肿瘤的增殖、侵袭和转移密切相关。食管癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一,进展较快,易发生转移,预后较差。近期研究表明,PAR-2在食管癌及食管肠上皮化生组织中表达,且其表达部位主要分布于食管腔内。据此我们推测PAR-2有可能被消化道反流液中的胰蛋白酶激活参与食管癌的进展。然而,目前并无相关的研究报道。本研究中我们采用人食管癌细胞株EC109为靶细胞,观察该细胞中蛋白酶激活受体-2(Proteinase-actived receptors 2,PAR-2)的表达情况;研究内源性PAR-2激动剂胰蛋白酶和人工PAR-2激动肽SLIGKV对该细胞增殖、侵袭转移的影响;以及胰蛋白酶及PAR-2激动肽作用前后MMP-2、MMP-9表达的改变,探讨PAR-2受体介导的食管癌细胞增殖及侵袭转移的可能分子机制。方法:1 RT-PCR法和免疫细胞化学染色法检测EC109细胞中PAR-2 mRNA及蛋白的表达情况。2细胞生长曲线、MTT法检测胰蛋白酶和PAR-2激动肽作用前后食管癌细胞EC109增殖情况。3流式细胞术(FCM)检测胰蛋白酶和PAR-2激动肽作用前后细胞周期改变情况。4 Transwell小室法检测胰蛋白酶和PAR-2激动肽作用前后细胞侵袭和迁移能力的变化。5 RT-PCR法检测胰蛋白酶和PAR-2激动肽作用前后PAR-2、MMP-2、MMP-9 mRNA表达的变化。6明胶酶谱法检测胰蛋白酶和PAR-2激动肽作用前后MMP-2、MMP-9明胶酶活性的变化。结果:PAR-2在食管癌细胞EC109中的表达1免疫细胞化学染色法结果显示,EC109细胞与抗PAR-2多克隆抗体有很强的结合反应,PAR-2蛋白表现为棕黄色,着色主要在胞膜和胞浆中。2 RT-PCR检测PAR-2的mRNA表达:结果显示EC109细胞在基因水平表达PAR-2。分别用胰蛋白酶、PAR-2激动肽SLIGKV作用于EC109细胞后发现,PAR-2mRNA表达量分别为(0.781±0.045)、(0.653±0.029),均较对照组(0.491±0.032)显著增高(P<0.05),而PAR-2反激动肽VKGILS组PAR-2 mRNA表达量为(0.463±0.036),与对照组(0.46±0.032)相比差异无统计学意义(P>0.05)。PAR-2激动剂对食管癌细胞EC109增殖的影响1 MTT及细胞计数试验检测PAR-2激动剂(胰蛋白酶和SLIGKV)对EC109细胞增殖的影响,其结果显示当作用时间相同时,SLIGKV在5-50μmol/L、胰蛋白酶在0.1-10 nmol/L浓度范围内食管癌细胞的增殖与药物浓度呈正相关,且呈浓度依赖性。当药物浓度一定时,在1-60 h时间范围内,食管癌细胞增殖与作用时间呈正相关,且呈时间依赖性。而PAR-2反激动肽始终对EC109细胞增殖无明显影响。2流式细胞术发现:在一定浓度的胰蛋白酶及PAR-2激动肽作用下食管癌细胞EC109的细胞周期显著加快,处于G0/G1期细胞的百分比明显降低,S期、G2/M期细胞百分比、细胞增殖指数(PI)明显增加,与对照组相比有显著差异(P<0.05)。而PAR-2反激动肽无此作用。PAR-2激动剂促进食管癌细胞EC109侵袭转移1 Transwell小室试验检测EC109侵袭及迁移能力的变化:在迁移试验中,一定浓度的胰蛋白酶及PAR-2激动肽作用后,EC109细胞经变形运动通过微孔膜的细胞数明显多于对照组与PAR-2反激动肽组(80.8±10.9)(62.6±8.9) vs (41.3±7.2)(45.8±8.5),(P<0.05)。在细胞侵袭试验中,药物作用后EC109细胞发挥破坏Matrigel基质胶作用,进入微孔膜内的细胞数也显著高于对照组(72.5±9.2) (59.4±8.7) vs (31.6±6.6) (36.2±9.8),(P<0.05)。2 RT-PCR、明胶酶谱检测MMP-2、MMP-9mRNA表达变化:结果显示一定浓度的胰蛋白酶及PAR-2激动肽作用后细胞MMP-9mRNA的表达量明显高于对照组及反激动肽组(0.719±0.034) (0.466±0.042) vs (0.341±0.032) (0.370±0.021),(P<0.05),细胞水解明胶的能力也明显高于对照组及反激动肽组(75.6±6.1) (60.4±4.6) vs (44.9±4.2) (39.3±5.2),(P<0.05)。而对MMP-2的mRNA表达和水解明胶的能力无明显影响(P>0.05)。结论:1食管癌细胞EC109在基因及蛋白水平表达PAR-2受体。并且,PAR-2激动剂(胰蛋白酶和PAR-2激动肽SLIGKV)可在基因水平上调PAR-2表达。2PAR-2激动剂可通过加快细胞周期促进食管癌细胞EC109增殖,其促增殖作用呈现浓度-时间依赖性。3 PAR-2激动剂可促进食管癌细胞EC109侵袭及迁移,其促侵袭迁移作用可能与上调MMP-9有关,而与MMP-2无关。