论文部分内容阅读
糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病患者常见的并发症和主要的死亡原因之一,20%至40%的糖尿病患者发生一定程度的肾病。其发病机制十分复杂,它是一种胰岛素分泌减少(1型糖尿病)或胰岛素效应减弱(2型糖尿病)的长期并发症,最早的临床表现是微量白蛋白尿。目前的治疗仅旨在减缓疾病的进展,尽管规范的治疗方案包括严格控制血糖、高使用率的RASI类药物控制血压、积极干预生活方式,全球DN的发病率仍随着糖尿病的增加呈高速增长。因此,探讨DN的发病机制、从根源延缓DN的进展是当今国际医学界临床和科研工作中亟待解决的重要课题。足细胞胰岛素信号传导的中断(高胰岛素血症,胰岛素抵抗或绝对胰岛素缺乏)在糖尿病肾病的发病机理中起重要作用。足细胞胰岛素信号通路在正常肾脏功能中有关键作用,足细胞特异性敲除胰岛素受体(IR)的小鼠可表现出DN的许多特征,包括蛋白尿,肾小球基质积聚增加,肾小球基底膜增厚,足细胞凋亡和肾小球硬化等,所有这些都发生在完全血糖正常的环境,这证实了正常胰岛素信号和葡萄糖摄取在足细胞健康中的作用,并表明胰岛素信号调节足细胞功能独立于血糖水平,足细胞胰岛素敏感性的丧失可能对DN发展具有重要影响。神经肽Y(Neuropeptide Y,NPY)最早即1982年就有记载,Tatemoto等从猪脑组织中发现并分离提纯的一种广泛分布于哺乳动物体内的神经肽,是由36个氨基酸组成的胰多肽家族。Neuropeptide Y受体属于G蛋白耦联受体,目前已有6种受体被发现和鉴定,在细胞调节信号转导过程中起重要的作用。虽然NPY最初从脑中分离并在中枢神经系统中高度表达,但已经清楚地证明NPY在广泛外周器官中如心血管系统、内分泌系统、胃肠道和肾脏发挥生物活性。NPY可在肾脏生成和释放,通过肾血管和小管上的NPY受体发挥调节肾功能作用。2001年的diabetes报道了高表达NPY转基因小鼠的研究,研究者建立了中枢神经系统高表达NPY小鼠,高糖饲料喂养的小鼠相比对照小鼠表现出多食、体重增长加快,血清中葡萄糖及胰岛素水平提高,但是值得注意的是,小鼠并没有出现损害的葡萄糖耐受,也没有出现总胆固醇及甘油三酯的异常。提示NPY的高表达未必是有损害作用的。相反,有不少研究证实NPY对细胞的保护作用。例如,NPY保护小胶质细胞免受脱氧麻黄碱(METH)引起的细胞死亡。NPY保护大鼠皮层神经元免受β‐淀粉样蛋白的毒性。另外,研究发现胰岛的内分泌细胞中也有NPY阳性细胞和NPY的m RNA表达,其不仅在生长发育迟缓、多饮、多食等病理生理过程中起着一定的作用,还参与糖尿病多种并发症的发病机制,比如糖尿病肾病、自主神经病变、血管病变及糖尿病视网膜病变等,NPY可能通过自分泌和/或旁分泌的机制参与了抑制胰岛素释放的过程。胰岛细胞免疫荧光提示NPY和胰岛素共表达,进一步研究表明NPY的表达可能是其细胞分化和调控胰岛素信号通路的重要标志。故NPY的表达似乎与糖尿病及其并发症相关,但是NPY在糖尿病肾病发病机制中的作用尚不清楚,其与足细胞损伤的关系更是迄今未见报道。因此,本研究拟通过小鼠足细胞、db/db糖尿病小鼠模型,探讨NPY在DN足细胞胰岛素敏感性及足细胞损伤中的作用及相关机制。调控NPY信号通路涉及多种方式。近年来,在多种组织器官中发现AMPK可抑制NPY表达。AMPK在巨噬细胞促进FA氧化,以减少巨噬细胞炎症和胰岛素抵抗。研究发现,大鼠中AMPK的激活会引起NPY神经的激活,从而促进饮食。神经细胞中,AMPK抑制剂可直接降低NPY的表达水平。AMPK为AMP依赖的蛋白激酶,是调控生物能量代谢的关键因素,是研究糖尿病及其相关并发症的核心。研究报道AMPK调节作为糖尿病胰岛素调节的中心机制,AMPK被认为是胰岛素敏感性的正调节剂,据报道AMPK与增加的GLUT4易位和随后的葡萄糖摄取相关。因此本研究拟通过肾小球足细胞、db/db糖尿病小鼠模型,明确:(1)NPY是否可通过调节胰岛素受体信号通路改善足细胞胰岛素敏感性,及缓解高糖诱导足细胞损伤和db/db小鼠肾损害;(2)明确AMPK是否调控NPY表达,参与调控DN足细胞功能失调、改善胰岛素敏感性;为临床糖尿病肾病的防治提供新的治疗靶点。目的:探讨AMPK是否调控NPY表达,在高糖诱导足细胞损伤和调节足细胞胰岛素反应性中的作用及机制。方法:体外培养肾小球足细胞,将足细胞分为正常对照组,高糖刺激组,高糖刺激+NPY,高糖刺激+NPY+PI3K抑制剂LY294002,高渗对照组+scambled si RNA,高渗对照组+NPY si RNA,高渗对照组+NPY si RNA+GSK‐3β抑制剂AZD1080。经处理的各组细胞,预先使用100 nmol/L胰岛素处理15 min,提取总蛋白,western blotting检测胰岛素受体信号通路关键蛋白包括PI3K、p‐PI3K、AKT、p‐AKT、IR‐β以及GSK3β、p‐GSK3β水平。q RT‐PCR方法检测IR‐β及NPY m RNA水平,细胞免疫荧光方法检测各组足细胞内IR‐β表达情况,ELISA方法检测各组细胞上清NPY的表达情况。荧光D‐葡萄糖衍生物2NBDG进行足细胞葡萄糖摄取测定,CCK‐8检测各组细胞细胞生存活力,划痕实验测定足细胞迁移能力。结果:(1)NPY可上调高糖刺激足细胞中胰岛素受体信号通路,IR‐β表达水平和PI3K、AKT蛋白磷酸化水平明显升高。(2)NPY可抑制GSK3β蛋白磷酸化水平。(3)NPY可显著增加高糖刺激的足细胞葡萄糖摄取,使高糖组足细胞的生存活力从55.56±2.29%恢复至75.49±3.19%,并可抑制高糖诱导的增强的细胞迁移能力。(4)ELISA结果及q RT‐PCR结果示AMPK的激活可上调高糖刺激足细胞中NPY的表达。(5)相比高糖刺激对照组,AMPK激活可上调细胞中IR‐β表达水平和AMPK、PI3K、AKT蛋白磷酸化水平,下调GSK3β蛋白磷酸化水平。(6)高糖刺激后再用AMPK激活剂AICAR处理,细胞2‐NBDG摄取能力显著提高,使高糖组足细胞的生存活力从53.95±3.43%恢复至70.22±1.38%,并可抑制高糖诱导的增强的细胞迁移能力。结论:AMPK的激活可促进高糖诱导足细胞损伤中NPY表达增加,NPY可上调高糖环境足细胞中胰岛素受体信号通路,介导PI3K/Akt/GSK3β信号通路调节足细胞葡萄糖摄取,改善足细胞活性及迁移能力。目的:探讨AMPK调控NPY信号通路在DN小鼠肾损伤中的作用及机制。方法:将实验小鼠分组为:db/m组:db/m小鼠+生理盐水注射,db/db组:db/db小鼠+生理盐水注射,db/db+AICAR组:db/db小鼠+AICAR注射,db/db+NPY组db/db小鼠+NPY注射,dbdb+AZD1080组:db/db小鼠+AZD1080注射。收集小鼠24小时尿液及血送尿蛋白定量、血生化检测,同时收集肾组织行病理学检测,IR‐β行RT‐PCR及免疫荧光检测,分离获得肾小球后提取肾小球蛋白,western blotting检测AMPK、p‐AMPK、PI3K、p‐PI3K、AKT、p‐AKT、IR‐β、GSK3β、p‐GSK3β水平。q RT‐PCR方法检测IR‐β及NPY m RNA水平,ELISA方法检测db/m组和db/db组血清和肾组织NPY的表达情况。线性回归方法分析血清和肾组织NPY水平与DN进展的相关性。结果:(1)AMPK的激活可使db/db小鼠血清和肾脏组织中NPY蛋白表达及m RNA水平显著增高(p<0.01)。(2)db/db小鼠中,AMPK的激活、NPY的上调或GSK3β活性的抑制可使小鼠血糖及血清中肌酐、胆固醇、甘油三酯、血尿素氮水平均显著性降低(p<0.01),血清白蛋白水平含量则显著增高(p<0.01),且可明显改善糖尿病肾病小鼠肾脏病理改变。(3)DN小鼠中血清和肾组织NPY水平与血糖,血清肌酐,尿素氮,血浆甘油三酯,胆固醇,尿蛋白呈显著负相关(P<0.05),而血清和肾组织NPY水平与血清白蛋白呈显著正相关(P<0.05)。(4)AMPK的激活、NPY表达增加可上调db/db小鼠肾组织中胰岛素受体信号通路,IR‐β表达水平和PI3K、AKT蛋白磷酸化水平均明显升高,GSK3β蛋白磷酸化水平显著降低。(5)AMPK的激活、NPY表达增加或抑制GSK3β可显著改善db/db小鼠中GLUT4蛋白水平的降低。结论:AMPK的激活可促进db/db小鼠血清和肾组织中NPY表达增加,再通过上调db/db小鼠中胰岛素受体信号通路,上调GLUT4蛋白的表达,介导PI3K/Akt/GSK3β信号通路改善肾损伤,起治疗作用。